المنطق، خطوات التجريبية، وإمكانية البناء الحيوي المنتج من غيري الطبيعية وتتميز هذه الاريثروميسين مجمع المضادات الحيوية المنتجة من خلال A E. القولونية

التخليق الحيوي غير المتجانس هو طريقة تتضمن إعادة إنتاج مسار التخليق الحيوي من كائن حي عبر التعبير المنسق للجينات في كائن مضيف آخر. في هذه التجربة ، يتم نقل مسار التخليق الحيوي للإريثروميسين أ إلى نظام مضيف الإشريكية القولونية بهدف نهائي هو إنتاج كميات كبيرة من هذا المضاد الحيوي. أولا ، يتم عزل مجموعة الجينات المسؤولة عن تكوين الإريثروميسين عن المضيف البكتيري الأصلي.

ثم يتم إعادة تصميم المادة الوراثية الغريبة في شكل أوبرا للتعبير المنسق عن المسار الأنزيمي الكامل في الإشريكية القولونية. مع تكاثر سلالة الإشريكية القولونية التي تحمل مسار الإريثروميسين غير المتجانس في الثقافة ، يتم إنتاج مركب الإريثروميسين النهائي. يمكن بعد ذلك اختبار نشاط المضادات الحيوية للمركب باستخدام الاختبار الوظيفي للعصيات المنفردة بدلا من إنتاج المنتجات الطبيعية المعقدة من خلال الكائنات الحية الأصلية.

يوفر التخليق الحيوي غير المتجانس من خلال الإشريكية القولونية الفرصة لسرعة العملية والإمكانيات الهندسية. بدأت هذه الفكرة منذ حوالي 10 إلى 15 عاما ، ولكن في الآونة الأخيرة فقط مع العديد من الاختراقات التقنية والتحسينات في تقنيتنا ، تمكنا من رؤية قصص نجاح حقيقية للإنتاج المعقد للمنتجات الطبيعية باستخدام الإشريكية القولونية أولا تصميم وطلب بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم جميع الجينات المرتبطة بالكتلة داخل الكروموسوم. بالنسبة لتفاعل البوليميراز المتسلسل ، استخدم الحمض النووي الجيني المحضر حديثا كقالب.

إذا كانت الجينات المستهدفة تحتوي على نسبة عالية من GC مثل مجموعة الإريثروميسين A في S eryri ، فأضف أربعة ميكرولترات من DMSO في تفاعل 50 ميكرولتر. تأكد من هوية منتجات PCR عن طريق التسلسل. ثم استنساخ منتجات الجينات PCR في نظام تعبير e coli أثناء cin، استخدمنا النمط الثامن كناقل تعبير لجينات معينة منذ إدراج التسلسل الرائد النهائي أضاف البروتين على التعبير.

بعد ذلك ، قم بتأكيد التعبير عن مستحضر البروتين الوظيفي. باستخدام تحليل صفحة R-T-P-C-R-S-D-S أو فحوصات النمط الظاهري الملائمة ، تقوم الآن ببناء أوبرا بناء على الجينات التي تم التعبير عنها بنجاح من البلازميد الفردي. إذا أمكن ، قم بتصميم مجموعات من إنزيمات التقييد المتماسكة المتوافقة لتحويل الجينات بالتسلسل.

أثناء عملية الإنشاءات المفتوحة ، نحتاج إلى التأكد من أن إنزيم القيود الذي استخدمناه لا يقطع التسلسل الفردي. إذا كان الأمر كذلك ، فنحن بحاجة إلى النظر في تخليق الجينات تابع لتوحيد 20 جينا من الإريثروميسين A في بلازميدات التعبير. مع مراعاة العوامل المفصلة في المخطوطة المصاحبة.

الآن قم بتحويل سلالة القولونية الإلكترونية BAP واحدة مع بلازميدات التخليق الحيوي المصممة حديثا إما بالتتابع أو في لوحة مجتمعة للخلايا على وسط LB صلب يحتوي على مزيج من المضادات الحيوية لاختيار صيانة البلازميد. هذا أمر غير معتاد للغاية أننا نستخدم ستة اختيارات مختلفة من المضادات الحيوية لتحولات E Cory ، ولكن هذا ببساطة لأننا نحتاج إلى ستة بلازميد للتخليق الكلي للإريثروميسين A في الكولين. يحدد هذا القسم الظروف الثقافية للنشاط المنسق لمسار الإريثروميسين A الكامل.

تم تصميم Gen BP one لتوفير الركيزة اللازمة ل CIN ، وهو توليف حيوي ، وتعديل التخليق الضخم IDE. اختر مستعمرات منفصلة من BAP واحد المحول حديثا وقم بتلقيح ثلاث مزارع سعة 1.5 ملليلتر في وسائط alb التي تحتوي على اختيار البلازميد المطلوب. المضادات الحيوية ، 100 ميكرومولار IPTG ملليغرامان لكل مليلتر من الأرابينوز للحث على التعبير الجيني و 20 ملليمولار بروبيونات الصوديوم.

لدعم ثقافة تكوين السلائف التخليقية الحيوية داخل الخلايا ، الخلايا عند 22 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة لمدة 24 إلى 48 ساعة. أخذ عينات دورية من المزرعة لتحليل استقرار البلازميد أثناء النمو. قم بتوضيح الثقافات عن طريق الطرد المركزي عند 10،000 دورة في الدقيقة.

قم بإزالة المادة الطافية وتخزين الحبيبات عند أربع درجات مئوية لتحليلها. لتأكيد وقياس تكوين الإريثروميسين ، قم بحقن المادة الطافية المزروعة على نظام LC MS. قم أيضا بتشغيل عينات قياسية من الإريثروميسين A المتاح تجاريا للحالات التي لا تحتوي على المعايير المتاحة تجاريا.

سيحتاج المركب إلى توصيفات كيميائية إضافية بواسطة MR وقياس الطيف الكتلي عالي الدقة. قارن الإنتاج بين المستحضرات الثلاثة وحدد أعلى منتج. قم بإعداد مخزون الجلسرين من مصدر المستعمرة وتخزينه على درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية مع أعلى مخزون منتج.

ابدأ ثقافة إنتاج الإشريكية القولونية المنفصلة ، واستخرج المادة الطافية النهائية بمجلدين من أسيتات الإيثيل. ثم جفف المستخلص في فراغ سريع ، وقم بتعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من الميثانول. ثم انقل المستخلص إلى قرص مرشح معقم وجففه بالهواء بشكل منفصل.

تطبق الثقافة B في سائل LB طوال الليل ، أضف 20 ميكرولترا من الثقافة B إلى 20 مل من أجار رطل السائل عند 45 درجة مئوية وقم بإعداد طبق. الآن ، ضع قرص مرشح الإريثروميسين A على المنعل الصلب B الذي يحتوي على حضانة أجار عند 37 درجة مئوية. في هذا المثال ، يتم نقل مجموعة الجينات الإريثروميسين من مجرى البول S إلى الإشريكية القولونية بعد إنتاج الإريثروميسين A من المضيف غير المتجانس اله.

يتم تحليل المنتج النشط بيولوجيا في كروموسوم S ETH ثلاثة A. يتم تنظيم مجموعة الجينات الإريثروميسين في 55 كيلوبايت من إجمالي الحمض النووي التالي للتعبير ، وهو مسار معقد للتخليق الحيوي يتطلب سلائف داخل الخلايا وإنزيمات التخليق الحيوي والخياطة بولي هايد يولد الإريثروميسين أ لنقل الجينات. يتم عزل الجينات الفردية أولا من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

ثم الجينات اللازمة لتكوين الإريثروميسين هي واحدة ، مستنسخة بشكل فردي في نواقل التعبير لتأكيد إنتاج البروتين ونشاطه من خلال صفحة SDS ومقايسات النمط الظاهري ، واثنان ، تم توحيده كأوبرا لنقل المسار الكامل في نهاية المطاف إلى e coli I تتطلب بعض الجينات التعبير مع تسلسل خمسة زعيم رئيسي ناتج عن متجه التعبير PET 28 ، بينما لم يفعل الآخرون. وتم تحليل التعبير عن الجينات الفردية لأول مرة بواسطة صفحة SDS. تظهر هذه النتيجة تقييما ظاهريا لجين ERME للإريثروميسين A المقاومة يستخدم الإريثروميسين A داخل الوسط الصلب لفحص سلالات القولونية الإلكترونية ، مما يؤوي البلازميدات مع أو بدون جين المقاومة ERME erythromycin.

من الواضح أن نمو الخلايا يتم إنقاذه باستخدام تعبير ERME. ثم يتم إدخال مسار الإريثروميسين A الكامل إلى e coli ، بما في ذلك البلازميد لمرافق EL المتنامي ، ويتم استخدام البلازميد الذي يحتوي على نسخة إضافية من التحويل الكهربائي URI K لإدخال البلازميدات إلى الإشريكية القولونية. ثم يتم تقييم استقرار البلازميد للسلالة النهائية.

تؤكد نتائج LCMS إنتاج الإريثروميسين. يتم تأكيد وظيفة مهمة من خلال المقايسات الحيوية المضادة للبكتيريا التي تنتج مناطق تثبيط في خطوط من البكتيريا B الدقيقة ، أو تحد من نمو الثقافة B في التخفيفات التسلسلية للإريثروميسين A.So مع عرض الفيديو هذا للحيوية غير المتجانسة المعقدة للمنتجات الطبيعية ، لديك الآن القدرة على تصميم وتنفيذ وتحليل الخطوات التجريبية الفردية المطلوبة لصنع منتج طبيعي غير متجانس كامل. من خلال تطبيق هندسة التمثيل الغذائي على خلية الإشريكية القولونية لتحسين السلائف المختلفة والمسار الذي تم إدخاله ، يمكنك زيادة إنتاج الإريثروميسين ، على سبيل المثال ، وهو ما تحدثنا عنه اليوم ، أو أي مركب آخر قد يكون ذا قيمة طبية أو يصعب إنتاجه.