调查轻度创伤性脑损伤海马电路功能的改变

以下实验的总体目标是探测受轻度创伤性脑损伤实验模型影响的大脑区域的网络功能的变化实验首先对小鼠进行外侧液体叩击损伤，该损伤模拟了人类轻度创伤性脑损伤的病理和症状。作为第二步，海马依赖行为、情境条件恐惧反应用于评估脑损伤引起的认知障碍。接下来，细胞外和细胞内记录以及电压敏感染料用于确定兴奋性和抑制性突触传递之间突触平衡的区域特异性变化在感兴趣的区域，海马体，结果显示海马体净突触功效的亚区域特异性变化基于对照小鼠和脑损伤小鼠之间的差异在所描述的三种记录技术中。

这种方法的主要优点是能够辨别病理状态和潜在疗法在多个生理尺度上的影响，从而可以更连贯地了解该回路缺陷。这种方法可以帮助回答有关创伤性脑损伤的关键问题，例如具体哪些神经元最容易受到损伤，因此对损伤后海马功能障碍的贡献最大。我们方法的意义延伸到创伤性脑损伤的治疗，因为它使我们能够首先描述潜在的机制，然后开发潜在的疗法，在因脑损伤而受损的区域恢复机器人的生理机能。

在此过程中，使用腹膜内给予氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物麻醉小鼠。接下来，使用外径为 3 毫米的齿条在右侧顶叶区域进行 C 型开颅手术。然后使用氰基丙烯酸酯和牙科丙烯酸将诱饵锁针座固定在 C 型开颅术上。

24 小时后 通过吸入使用 Isof Fluorine 麻醉小鼠 一旦恢复正常呼吸，但在小鼠对刺激变得敏感之前，通过液体叩击伤害装置向颅骨输送 20 毫秒的生理盐水脉冲。受伤后立即拆下轮毂。随后使用 isof fluorine 重新麻醉小鼠并缝合头皮。

在条件性恐惧反应训练前连续两天处理鼠标。在训练当天，将鼠标放入调节室中 3 分钟，然后进行 1.5 分钟的安培地板电击 2 秒。然后将鼠标在腔室中再放置 30 秒，然后再取出。

延迟 24 小时后，将鼠标放回调节室 5 分钟，然后在受伤后 7 天以 5 秒的间隔评估冻结情况。准备 1 升人工脑脊髓液和 250 毫升蔗糖切割液。确保脑切片制备过程中使用的所有仪器和溶液都是冰冷的。

使用 isof fluorine 快速温和地麻醉小鼠。从小鼠中取出大脑并放入蔗糖中。接下来，修剪大脑。

将新鲜切割的大脑表面放在琼脂块前面的 Vibram 舞台上的一滴强力胶上。切下 350 微米厚的冠状切片。您应该能够获得四到五个海马回路完整的切片。

之后，将切片在 37 摄氏度下孵育至少一小时。现在准备一些 2 到 5 兆欧姆的硅酸盐玻璃电极。使用垂直拉拔器，将切片转移到腔室中，然后将电极放在电极支架上以进行细胞外场电位记录。

将刺激电极放置在切片上轴突束上方，例如 perent path 或 Shafer 侧支。然后继续将记录电极放入切片中。接下来，传递单个电脉冲以唤起场细胞外突触后电位。

当达到最大响应时，继续刺激改变刺激之间记录电极的深度。这表明电极处于同一位置。Z 水平分析通常包括测量，比较脑损伤和假手术小鼠的纤维凌射幅度以评估突触前激活，以及比较 F-E-P-S-P 的斜率以评估突触后激活以再次膜片钳记录，将切片转移到腔室并降低记录电极。

在电极上施加正压接近电解池，以确保记录电极在向下穿过组织时不会堵塞。当电极轻轻接触细胞时，施加负压，以便在电极和质膜之间形成千兆密封。接下来，施加短时间的负压脉冲以破坏质膜以实现全细胞配置。

使用放大器消除电容瞬变并补偿串联电阻，以确保准确测量。然后量化和比较脑损伤小鼠和假手术对照中自发突触电流的速率和大小。在此步骤中，通过将 1 毫克染料与 3 个 onap DHQ 混合在 50 微升乙醇中来制备染料原液。

两微升等分试样分配到铝箔包装的试管中，并在零下 20 摄氏度下储存。每天在 A CSF 中以 1 至 200 的稀释度制备工作染料溶液。然后在 A CSF 湿滤纸上孵育一片，并用 90 μL 染料染色 16 分钟。

之后，冲洗干净并将其放入界面记录室中。按照细胞外场中的说明放置刺激和记录电极。可能的记录。

调整光刺激强度，直到响应位于相机中间。范围图像通常以每秒 500 到 1000 帧的速率采集。在电刺激前 200 毫秒触发快门进行光刺激，以使初始快速光漂白稳定下来。

在两次试验之间暂停 10 秒。在电刺激和非电刺激之间交替进行采集试验，以允许稍后减去非电刺激背景。然后在打开快门之前记录静止光强度。

每个 VSD 试验都可以作为荧光读数的电影进行分析。也就是说，每个试验都是一个三维数据矩阵，其值在时间上以 X 和 Y 空间维度表示。在每个测试条件下记录 10 到 12 个 VSD 试验，并根据随附的手稿计算像素内照明前归一化荧光变化。

此图显示了在区域 CA 1 中录制 F-E-P-S-P 的示例。第一个向下偏转是刺激伪影，然后是突触前纤维凌空抽射，然后是 F-E-P-S-P。以下是描述液体叩击损伤后 CA one 净突触效能降低的输入输出曲线。

以下是描述 FPI 后齿状回净突触功效增加的输入输出曲线。这是来自 CA one 副金属细胞的自发兴奋性突触后电流的示例。这是来自 CA one 寄生金属细胞和快速尖峰 ca one 间神经元的动作电位序列的示例。

这是一个路西法黄色填充的 ca one 抑制性神经元，没有树突状棘，这是一个路西法黄色填充的 ca one 具有树突状棘的准金属神经元。这些图显示了小鼠冠状海马切片。黄色到红色的像素表示传入 shafer 侧支刺激后 14 毫秒内区域的兴奋性活动。

红色表示去极化较多，而黄色表示去极化较少但仍显著。蓝色像素表示在相同的传入 Shafer 侧支刺激后 ca 1 56 毫秒区域的抑制活性位点，而深蓝色表示更多的超极化。观看此视频后，您应该对如何结合多种离体记录技术来解决涉及回路功能障碍的临床相关病理状况有很好的了解。