תמונה רציפה-הלבנה להתוות תאי שווא יחידים בצומת Neuromuscular

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לתאר תאי שוואן בודדים בצומת העצבי-שרירי באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. פרוטוקול זה משתמש בעכברים טרנסגניים המבטאים GFP בתאי שוואן טרמינליים ואקסונליים. הצעד הראשון הוא לנתח הסבר שריר עצבי.

לאחר מכן מבוצעת הלבנה רציפה של כל תאי השוואן מלבד אחד בצומת עצבי-שרירי נתון החושפת מורפולוגיה של תא בודד. לבסוף, נוצרת מפת הספק נמוך. הרקמה מקובעת ומשמשת לאימונוהיסטוכימיה כדי לדמיין כל סמן רצוי ביחס לתא השוואן הלא מולבן שנותר.

התוצאות מראות מורפולוגיה של תא בודד ובמידת הצורך מיקרוסקופ זמן-lapse או ניתוח קולוקליזציה אימונוהיסטוכימית ברקמה קבועה המבוססת על הדמיה קונפוקלית. אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי המורפולוגיה והטריטוריה של תאי ברבור בודדים בצומת העצבי-שרירי. ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כגון קווי תאים, פרוסות מוח חיות, או אפילו מינים אחרים כמו דג הזברה.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שנדרש ניסיון מסוים כדי לזהות צומת עצבי-שרירי שטחי מספיק ולא לבזבז זמן על מבנים שפשוט לא שווים את המאמץ לפני תחילת הניתוח, חמצנו וקררו את תמיסת הצלצול למשך 15 דקות לפחות. מניחים צלחת תרבית רקמה בגודל 15 ס"מ עם קרח מתחת למיקרוסקופ. מכסים אותו בצלחת מתכת.

הניחו את צלחת תרבית הרקמה בגודל 10 סנטימטר מלאה בתמיסת צלצול על צלחת המתכת. הנח את אבן החמצון לתמיסה. השלב הבא הוא לבחור עכבר שתאי הברבור והאקסונים שלו מסומנים בצבעים שונים.

לאחר המתת החסד של העכבר, יש לרסס אותו באתנול כדי למנוע זיהום פרווה, השתמש במספריים גדולים כדי לבצע חתך בקו האמצע מעל עצם החזה ושני חתכים במקביל לקצה התחתון של כלוב הצלעות. הסר את העור, פתח את הבטן ונתח את שרירי החזה בעזרת חתכים קרובים להחדרת השריר בעצם החזה. השתמש במלקחיים כדי להחזיק את סחוס ה-xiphoid ולחתוך את הסרעפת ממש מתחת לסחוס ה-xiphoid.

נתח את הסרעפת לאורך החדרות החוף שלה. מדי פעם הרטיבו את הרקמה בתמיסת רינגר כדי למנוע ייבוש באמצעות מלקחיים כדי להחזיק את כלוב הצלעות בתהליך ה-xiphoid. התחל לחתוך את הצלעות מעמוד השדרה קרוב ככל האפשר להחדרתן.

החתכים השמאלי והימני צריכים להתכנס מעל הלב לכיוון העין הירכתית של המנובריום. נסו להימנע מחיתוך כלי דם עיקריים, במיוחד הוורידים התת-בריחיים. לנראות טובה יותר.

הרם בעדינות את התכשיר תוך אחיזה בתהליך ה- xiphoid בעזרת מלקחיים. כעת בצע חתך רוחבי ממש מתחת לעין הירכתיים של המנובריום כדי להסיר את בית החזה ולהעביר את ה-X לתוך צלחת 10 סנטימטר עם תמיסת הצלצול המוכנה. הניחו את המנה על צלחת המתכת ואת הכלי המלא בקרח מתחת למיקרוסקופ מתחת למיקרוסקופ.

בעזרת מספריים קפיציים קטנים, הסר את שאריות התימוס, הצדר, הסרעפת ושרירי החזה. בעזרת מספריים קפיציים קטנים, נתחו את כל הצלעות שאינן נכנסות לעצם החזה. חותכים את הרקמה בין הצלעות.

זה מאפשר ל-X explan להתאים לכלי מצופה מגן SIL בגודל 3.5 סנטימטר. כעת באמצעות שמונה עד 10 סיכות מינוצ'ין מקוצרות, הצמד את ה-X, הימנע משריר העין הירכתיים המשולש שצוין כאן. שני סיכות צריכות לעבור דרך החלקים הסחוסיים של עצם החזה, ושני סיכות צריכות לעבור דרך החלקים הסחוסיים הרכים יותר בין הצלעות.

הימנע מניקוב הצלעות מתחת לשריר המשולש או קרוב אליו. ממשיכים להצמיד עד שהצלעות מתפשטות מעט. קיבוע השריר למצב מתוח מעט.

העבירו את הצלחת המצופה מגן אדן 3.5 ס"מ למיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בלייזר ארגון ומטרות טבילה במים. למיקרוסקופיה של זמן-lapse, הכנס את הכלי המצופה מגן אדן 3.5 ס"מ לתוך טבעת החימום. התקן מערכת היתוך והתקן בדיקת טמפרטורה.

ודא ששום דבר לא נוגע באקספלור, בשולי המנה או בציפוי הסיגר. עבור מיקרוסקופיה של זמן-lapse, יש לחמם את ה-Xplan, אך עבור הלבנת תאי שוואן טמפרטורת החדר טובה יותר. עכשיו עם מטרת אוויר במט"ח, התבונן בדפוס העצבנות של שריר העין הירכתיים המשולש ומצא את רצועת צלחת הקצה המשולשת.

עבור למטרת חרוט הטבילה 20 x והתחל לחפש אזורים שטחיים בתוך אזורי רצועת ה- nplate. מעל הצלעות וקרוב לעצבים הבין-צלעיים נמצאים אזורים מועמדים טובים. עבור למטרת חרוט הטבילה של 100 x או 60 x כדי לבדוק את הפרט וה-mjs.

באופן אידיאלי אתר NMJ המכוסה על ידי מספר תאי שוואן הממוקם באופן שטחי מאוד קריטי להצלחת פרוטוקול זה הוא למצוא את הצומת העצבי-שרירי השטחי והשטוח שלהם. מכיוון שהצומת העצבי-שרירי מחדשת סיבי שריר גליליים, הוא נוטה להיות כרוך סביב הסיב ולידיים לרוב אין את הזווית המושלמת להדמיה. בחר רק את הצמתים העצביים-שריריים שהם שטוחים שטחיים ועל פני השטח כעת באמצעות יעד צמצם מספרי של 100 x 1.0.

עם זום 2.5, רכוש תמונה קונפוקלית של ה- NMJ. הגדרות אלו מספקות גודל פיקסלים של כ-0.1 מיקרומטר, מה שמבטיח דגימה מרחבית נכונה על פי קריטריון nyquist. כעת פוטו-אקונומיקה את תא השוואן על ידי חניית קרן הלייזר של 488 ננומטר במרכז הגרעין תוך שימוש בעוצמה מקסימלית למשך חמש שניות.

לאחר מכן, התמקדו מחדש בתא ושפטו את תוצאת ההלבנה. במידת הצורך, חזור שוב על שלב ההלבנה עד שרמות ה-GFP יופחתו לרמות רקע קרובות, ולאחר מכן רכוש תמונה נוספת. זה קריטי לוודא שהאזור המולבן נמצא מחוץ לכל חפיפה בין שני תאים.

אם יש חפיפה, הלבנה בתא שני תהיה ברורה. כאשר היא נעשית כראוי, גישה זו מביאה לתאים סופיים שנחשפו בבירור, לעתים קרובות עם מורפולוגיה מפתיעה למדי שלא ניתן היה לנחש לפני תחילת ההליך. חזור על תהליך ההלבנה עד שכל תאי השוואן מלבד אחד מולבנים.

תא השוואן האחרון שלא הולבן מתאים למיקרוסקופיה קונפוקלית של זמן-lapse. לאחר השלמת הדמיית הזמן-lapse, צור מפה של ה-njs הללו על ידי צילום תמונה ב-100 x ללא זום, ולאחר מכן תמונות של האזור באמצעות המטרה של 20 x וחזור על התהליך באמצעות המטרה ארבע x. מפה זו נחוצה כדי למצוא njs בעקבות כימיה אימונוהיסטית של שריר קבוע.

לאחר הדמיה והלבנה שחרר את האקספלן והעבר אותו לצינור של 50 מיליליטר עם לפחות 15 מיליליטר של 4% PFA. לאחר מכן הניחו את הצינור על קרח למשך שעה לאחר קירור הרקמה למשך שעה, שטפו אותו עם 0.1 גליצין מולארי ב-PBS למשך 10 דקות לפחות. לאחר מכן העבירו את האקספלן הקבוע לצלחת תרבית רקמות מצופה מגן משי של חמישה סנטימטרים במילוי PBS מולארי של 0.01 והתכוננו לנתח עוד יותר את האקספלן.

ראשית, גזרו צורת טרפז כשצד אחד מקביל לעצם החזה והשני דרך מעברי העצם לסחוס. זה מכיל את שריר המשולש על פני השטח שלו. לאחר מכן, הסר את הצלעות התחתונות עם חתך אופקי או טרנססטרנלי כך שניתן יהיה לגשת באופן חופשי לקצה הקיפוד של שריר המשולש.

כעת הכנס מחט היפודרמית כסיכה לחלקו העליון של הטרפז. לאחר מכן, הסר את שריר המשולש. ראשית, השתמש במלקחיים כדי להחזיק בעדינות את פינת השריר.

ושנית, השתמש במזרק ובמחט כמו אזמל מיקרו כדי לחתוך במקביל למישור דופן בית החזה. לאחר שחרור החלק המפונק של השריר, הכנס מחט נוספת מתחת לשריר דרך דופן בית החזה כדי לשתק את התכשיר. תוך כדי חיתוך החדרות רקמת החיבור, קלף את השריר מבית החזה במשיכה עדינה מהמלקחיים.

לבסוף, הסר שאריות שומן וכלי דם באמצעות מלקחיים. היזהר לא לקרוע את העצבים. השריר המשולש מוכן כעת לאימונוהיסטוכימיה.

מפרט עין ירכתיים משולש באמצעות עכברים המבטאים GFP תחת מקדם PLP הוכן להדמיה ex vivo של תאי שוואן. ניתן היה לדמיין אקסונים בו-זמנית על ידי חציית P-L-P-G-F-P לירך OFP אחד שלושה עכברים. באמצעות הפרוטוקול המתואר, המורפולוגיה של תאי שוואן טרמינליים בודדים התגלתה בפירוט גבוה להפתיע על ידי הלבנת שני תאי השוואן הטרמינליים השכנים ותאי השוואן האקסונליים הראשונים.

צמתים עצביים-שריריים מדומים אותרו לאחור באמצעות המפה שנוצרה מראש ונסרקו ברזולוציה גבוהה ברקמה הקבועה לאחר מיקרוסקופיה קונפוקלית חיה, המשטח המשולש של הירכתיים תוקן ונצבע. מוצגים כאן קולטני אצטילכולין המסומנים בטואין בונגלו יחד עם Alexa 6 47 באדום ושלפוחיות סינפטיות המסומנות בנוגדנים אנטי סינפטופיזין בלבן. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לדמיין את המורפולוגיה של תאים בודדים, שבתחילה כולם סומנו על ידי אותו חלבון פלואורסצנטי וארוזים בצפיפות רבה מדי מכדי לפתור בנפרד.

הדוגמה שלנו מציגה את הצומת העצבי-שרירי, אך ישנם יישומים פוטנציאליים רבים אחרים.