Name: HUES repiquage souches embryonnaires humaines lignées cellulaires à la trypsine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-10-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Découvrez le repiquage des lignées cellulaires souches embryonnaires humaines HuES à la trypsine. Cette méthode standardisée préserve la stabilité génétique et l'état indifférencié des cultures pour la recherche.

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Général Nous vous recommandons de dégel pas plus d&#39;un échantillon à un moment donné pour assurer une manipulation facile. Le gestionnaire doit prendre soin de ne pas laisser des cultures à la température ambiante et de faibles émissions de CO2 pendant de longues périodes de temps. Tous centrifugation des cellules vivantes se fait à 500-600 g pendant 5 min à température ambiante. FAE (cellules de souris embryonnaires Feeder) <ol><li> Préchauffer les médias MEF à 37 ° C. Retirez le flacon MEF de -80 ° C et immédiatement plonger la moitié inférieure du tube dans un bain à 37 ° C l&#39;eau. Il devrait prendre environ 30-45 secondes avant que les cellules sont décongelées 80% (petite partie gelée à gauche). </li><li> Vite, apportez le tube à la hotte à flux laminaire, par pulvérisation avec de l&#39;alcool à 70%, et le transfert aux cellules de pré-chauffé médias. </li><li> Aspirer la solution de gélatine à partir de plaques préparées auparavant. </li><li> Aliquote de 2 ml de solution MEF dans une goutte de manière sage dans chacun des six puits. Soyez sûr de distribuer les FAE uniformément sur le bien. Date de la plaque du MEF, et placer dans un incubateur à 37 ° C pendant la nuit pour permettre aux FAE à attacher à la plaque. </li><li> Après 6 heures FAE sera attaché à la plaque. Il est préférable d&#39;utiliser des plaques MEF 24-48 heures après placage. NE PAS utiliser une plaque MEF qui est de plus de 4 jours. </li><li> Préchauffer les médias teintes et 0,05% de trypsine / EDTA à 37 ° C sous le capot, une prelabel stérile de 50 ml tube conique. </li><li> Aspirer délicatement les médias couleurs de la culture pour être divisé. Lavez délicatement les puits avec 2 ml de solution de tampon phosphate 1X (PBS) par puits. Aspirer le PBS. Ajouter 0,75 ml 0,05% de trypsine / EDTA pour le bien. </li><li> Replacer le couvercle, et d&#39;observer les cellules sous un grossissement de 4x. La FAE entourant les colonies HUES devrait commencer à se rétracter. Lorsque la FAE sont suffisamment arrondis et les frontières des colonies teintes sont rugueux, le retour de la plaque à la hotte. Ce processus devrait prendre environ 5 minutes, absolument pas plus de 10 minutes ou vos cellules ne sera pas re-pousser. </li><li> Délicatement la pipette de haut en bas, le lavage au fond du puits, jusqu&#39;à ce que la monocouche MEF a complètement détaché (monocouche est collante et peut rester en un seul morceau). </li><li> Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 ml contenant multimédia supplémentaire teintes. Spin le tube de cellules 500xg pendant 5 min, Aspirer les médias, attention à ne pas perturber le culot cellulaire. </li><li> Pour plaque sur une nouvelle plaque d&#39;FAE, ajouter le volume déterminé de manière appropriée des cellules vers d&#39;autres supports teintes, et la pipette la solution 5-7 fois avec une pipette automatique. </li><li> Retirez le support du MEF à partir d&#39;une plaque fraîche de FAE. </li><li> Aliquoter la chute solution HUES sage de chaque puits, en veillant à répartir équitablement les gouttes sur le bien. Sans secouant la plaque, avec précaution les cellules d&#39;un incubateur à 37 ° C pendant la nuit pour laisser HUES colonies semences. </li><li> Cellules HUES sortant d&#39;une scission devrait se comportent comme ceux qui sortent d&#39;un dégel. </li></ol>

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</ol>

Dans cette vidéo, nous avons démontré comment nous HUES passage couramment lignées de cellules souches dans notre laboratoire. Fractionnement efficace et régulière et repiquage est essentiel pour maintenir une bonne santé humaine ligne de cellules souches embryonnaires. Passage de la médiation trypsine est un avantage significatif de teintes des lignées de cellules, cependant, il est important de ne pas trop trypsiniser cultures ou d&#39;avoir une grande proportion de cellules individuelles pendant le re-Platting.

HUES média 651,5 ml KO-500 ml de DMEM Penstrep 6,5 ml 6,5 ml GlutaMAXTM NEAA 6,5 ml de 2-mercaptoéthanol 0.5ul KO Sérum Remplacement 65 ml à 65 ml Plasmanate bFGF2 (10 ng / ml final) 0,65 ml

hues repiquage souches embryonnaires humaines lignées cellulaires à la trypsine

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

Dans cette vidéo, nous montrons comment notre laboratoire passages couramment HUES humaine lignées cellulaires embryonnaires souches à la trypsine. Cellules souches embryonnaires humaines sont des artefacts de la culture cellulaire, et ont tendance à acquérir anomalies chromosomiques avec doublements de population élevée. Repiquage correcte est essentielle pour maintenir une bonne santé, indifférenciée, des teintes caryotype humain normal de la culture de cellules souches embryonnaires. Tout d&#39;abord, une culture de l&#39;expansion est lavé dans du PBS pour éliminer les médias résiduelles et les débris cellulaires, puis les cellules sont recouvertes avec un volume minimal de 0,05% au chaud trypsine-EDTA. La trypsine est à gauche sur les cellules pour un maximum de cinq minutes, puis les cellules sont doucement délogés avec une pipette de 2 mL sérologique. La suspension cellulaire est recueilli et mélangé avec un volume important de médias teintes, puis les cellules sont collectées par centrifugation douce. La trypsine inactivé média mélange est éliminé et les cellules remises en suspension dans les médias HUES préchauffé. Un rapport de division appropriée est calculé (généralement 1:10-1:20), et les cellules re-plaqué sur une plaque 1-2 jours anciens contenant une monocouche de cellules embryonnaires de souris irradiées alimentation fibroblastes. La plaque de culture nouvellement ensemencé HUES n&#39;est laissé au repos pendant 48 heures, puis les médias est changé tous les jours par la suite. Il est important de ne pas trpsinize jusqu&#39;à une suspension cellulaire unique, car cela augmente le risque d&#39;introduction d&#39;anomalies chromosomiques.

Dans cette vidéo, nous montrons comment notre laboratoire passages couramment HUES humaine lignées cellulaires embryonnaires souches à la trypsine.

HUES repiquage souches embryonnaires humaines lignées cellulaires à la trypsine

Dans cette vidéo, nous démontrons comment notre laboratoire effectue habituellement le repiquage de lignées de cellules souches embryonnaires humaines HuES à l'aide de la trypsine. Les cellules souches embryonnaires humaines sont des artéfacts...

C’est-à-dire, où avez-vous dirigé The Techniques ? Oh, où vous ai-je enseigné ? Belcher.Ouais.La première fois que je t’ai enseigné Bel, j’ai passé l’été à mon T.Ouais.Et c’était comme, on a fait comme du cartilage là-bas. Et donc j’aimais la culture sociale là-bas. Et puis à Hopkins, ma dernière année, j’ai travaillé avec différents, donc moi, pour l’ingénierie, il s’agissait beaucoup plus d’essayer, nous concevons en trois dimensions.

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Cette vidéo montre comment faire pousser des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sur les cellules de fibroblastes de souris embryonnaires d'alimentation (MEF).

De MEFs à I Matrigel: CSEh repiquage en présence du MEF

La différenciation de l'ESC coïncide avec un type de cellule des changements spécifiques dans la structure et la composition de la chromatine. La détection de ces changements fournit de précieuses indications sur les mécanismes qui définissent stemcellness et la différenciation cellulaire. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) représente une méthode utile pour disséquer les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la différenciation des cellules souches.

Immunoprécipitation de la chromatine des cellules souches embryonnaires humaines

Cette vidéo montre comment maintenir la croissance de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) dans le chargeur sans cellules conditions et la manière de CSEh passage en continu dans le chargeur sans cellules conditions. Confirmation de CSEh pluripotence grandi dans le chargeur sans cellules par microscopie d'immunofluorescence conditions est également démontrée.

De FAE au Matrigel 3: Le repiquage du Matrigel CSEh sur Matrigel

Caryotype est une technique simple et utile largement utilisé pour détecter les altérations génétiques. Nous décrivons ici une étape par étape pour la préparation du protocole propagation de chromosomes de cellules souches embryonnaires humaines pour la surveillance du statut chromosomique de ces cellules maintenues en culture.

Préparation Étaler chromosomique des cellules souches embryonnaires humaines pour le caryotype

Nous décrivons une molécule à base de petites protocole pour la différenciation des cellules souches embryonnaires de souris en cellules précurseurs des oligodendrocytes (OPC). Ce protocole génère Olig2 + NG2 + OPC avec un rendement élevé de 30 jours de différenciation. Nous décrivons également une méthode pour générer des "dopage" OPC qui peut tirer des potentiels d'action.

La différenciation des cellules souches embryonnaires en précurseurs d&#39;oligodendrocytes

Différenciation dirigée des CSEh dans des cellules spécifiques a suscité beaucoup d'intérêt en médecine régénérative. Nous fournissons un résumé concis, étape par étape pour déterminer le protocole...

Cartographie sort des cellules souches embryonnaires humaines par la formation de tératome

La technique de micro-disséqués explants est une méthode robuste et fiable pour isoler proliférative des cellules musculaires squelettiques de juvéniles, adultes ou embryonnaires muscles comme source de cellules souches du muscle squelettique. Uniquement, ces cellules ont été tirés par clonage pour produire des lignes squelettiques musculaires cellules souches utilisées pour la transplantation in vivo.

Adultes et embryonnaires Culture squelettique Microexplant musculaire et isolement de cellules souches du muscle squelettique

Ce protocole offre un moyen simple et efficace de propager des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) en utilisant uniquement des milieux conditionnés dérivés du placenta humain dans une boîte recouverte de gélatine sans supplémentation exogène supplémentaire ou substrats synthétiques spécifiques aux hPSC.

A Novel Culture Modèle de cellules souches pluripotentes humaines Propagation de gélatine dans les médias Placenta conditionné

La génération de cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes in vitro permet d’accéder à de grandes quantités de tissu cardiaque in vitro pour la science fondamentale et les applications cliniques.  Ce protocole utilise le facteur d’essai Grem2 pour augmenter le nombre de cardiomyocytes obtenus et pour générer des cardiomyocytes avec un phénotype auriculaire.

Différenciation des atrial cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes Utilisation de la BMP Antagonist Grem2

Cette méthode peut être utilisée pour examiner le raccourcissement des sarcomères à l’aide de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes avec des protéines sarcomères marquées par fluorescence.

Raccourcissement de Sarcomere de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes à l’aide de protéines sarcomères marquées par fluorescence.

Afin d’éviter les limitations associées au passage enzymatique ou mécanique des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et des cellules souches pluripotentes induites humaines (CSPhi) cultivées sur des cellules nourricières, nous avons mis au point une méthode rapide, efficace, rentable et à haut rendement pour la récolte de colonies de CSEh ou de CSPhi, maintenues sur une couche de cellules nourricières de fibroblastes de prépuce humain en utilisant la désadhésion médiée par l’EDTA.

Passage rapide, rentable et sans enzyme de cellules souches pluripotentes humaines sur des cellules nourricières par désadhérence médiée par l’acide éthylènediaminetétraacétique

Découvrez le repiquage des lignées cellulaires souches embryonnaires humaines HuES à la trypsine. Cette méthode standardisée préserve la stabilité génétique et l'état indifférencié des cultures pour la recherche.

HUES repiquage souches embryonnaires humaines lignées cellulaires à la trypsine

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