Isolement du liquide céphalo-rachidien à partir d'embryons de rongeurs pour une utilisation avec des explants cérébraux corticaux disséqué

L’objectif général de l’expérience suivante est d’observer le rôle des signaux sécrétés dans le LCR embryonnaire sur le développement du cortex cérébral. Ceci est réalisé en isolant d’abord le LCR embryonnaire pour l’utiliser comme milieu de culture. Dans les étapes suivantes, la paroi corticale cérébrale en développement est disséquée, placée sur une membrane de polycarbonate et flottée sur le LCR.

Les résultats montrent que le LCR embryonnaire fournit des signaux instructifs au cortex cérébral en développement sur la base de l’analyse des explants par coloration immunologique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du LCR. Par exemple, quels sont les composants du LCR, quelle est sa fonction à différents stades de développement et, espérons-le, aider à déterminer comment il pourrait un jour être utilisé comme véhicule thérapeutique pour les maladies neurodégénératives.

Il est essentiel que le LCR soit prélevé sans contamination et que les dommages à l’exvision corticale soient minimisés. Ces procédures peuvent nécessiter beaucoup de pratique, car elles impliquent de manipuler de petits tissus à l’aide d’outils de dissection très fins. Commencez par préparer les aiguilles des micro-pipettes.

Par exemple, sur un extracteur de micro-pipette vertical Orica PC 10, tirez des pipettes micro-capillaires de 10 à 20 microlitres avec les réglages suivants, un réchauffeur à traction en un pas numéro deux, réglé sur 58 et un poids de traction de 100 grammes. Cassez la pointe fine de la micropipette à l’aide d’une pince fine numéro 55. Le diamètre intérieur moyen de l’aiguille résultante sera de 85 micromètres.

Ensuite, préparez l’ensemble de l’aspirateur. Pour l’aspiration du LCR, insérez le micro-piston fourni avec les micro-pipettes capillaires dans l’aiguille capillaire. Vous pouvez également fixer un filtre jetable en plastique à l’extrémité du tube d’aspirateur relié à la micropipette capillaire.

Ensuite, à l’extrémité opposée de l’ensemble aspirateur, poussez l’aiguille à travers le joint et en position. Transférez maintenant un embryon isolé de souris ou de rat dans une boîte de microdissection préparée avec une protection sylique. Lavez l’embryon avec du HBSS stérile et retirez le liquide entourant l’embryon par aspiration et rembourrage avec du papier absorbant.

Visualisez l’embryon au microscope de dissection. S’il s’agit d’un embryon de souris, il doit être couché sur le côté, offrant une vue sagittale. Insérez maintenant régulièrement la pipette microcapillaire dans le ventricule latéral ou céphalique, le ventricule mésocéphale ou le sternum CI.

Magna essayant de ne pas entrer en contact avec les cellules neuro-épithéliales. Une fois la pipette insérée, n’insérez l’aiguille que jusqu’à ce que le tissu soit perforé. Maintenant, commencez avec précaution et douceur à aspirer le LCR dans la pipette en utilisant une légère pression négative créée par le micro-piston ou l’aspiration buccale.

Le LCR doit commencer à s’écouler doucement dans la micropipette capillaire de manière lente et contrôlée. Continuez à appliquer une pression négative jusqu’à ce que la collecte soit terminée. Il est essentiel que la collection produise un fluide clair et transparent.

S’il y a des signes de contamination par le sang, comme le rouge ou le jaune, jetez la collection dans les embryons de souris et de rat. Aux stades E 16,5 à E 17 ou avant, il est possible d’observer un léger affaissement du ventricule, là où la pipette microcapillaire est positionnée. Le flux de LCR s’arrêtera avec cet événement lorsque le flux se terminera, retirez délicatement la pipette micro capillaire.

Ensuite, expulsez doucement l’échantillon de LCR recueilli dans un microtube de centrifugation refroidi sur de la glace à partir d’une portée de souris E 14.5. Attendez-vous à collecter entre 10 et 15 microlitres de LCR lorsque toutes les collections seront complètes. Centrifugez le tube à 10 000 G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Pour éliminer toutes les cellules contaminantes, transférez le LCR transparent dans un nouveau tube. Il est maintenant possible d’effectuer un examen microscopique des contaminants s’ils sont jugés purs. L’échantillon peut être utilisé pour l’analyse, regroupé avec d’autres échantillons ou congelé avec de l’azote liquide et stocké à moins 80 degrés Celsius pour collecter des explants corticaux pour l’expérimentation avec des milieux supplémentés en LCR.

Dans un plat recouvert d’un cigare, exposez le cortex d’un embryon E 14.5. Retirez le duro avec le crâne en développement, mais laissez la pie-pied et l’arachnoïde attachés au cortex à l’aide d’un scalpel. Couper le cerveau en deux le long de la ligne médiane dans le plan médio-sagittal, séparant les hémisphères corticaux droit et gauche.

Préparez chaque hémisphère cortical séparément. Placez l’hémisphère médial vers le haut afin que vous puissiez voir l’imminence ganglionnaire et le cortex en développement. À l’aide du scalpel, faites une incision coronale à travers le dorlotement du neuroépithélium cortical jusqu’au bulbe olfactif en développement.

Cette incision doit commencer à la limite antérieure des éminences ganglionnaires latérales et médiales, et s’étendre à travers la région cingulaire antérieure du rudiment cortical en développement. Faites une autre incision coronale juste choyée à la limite postérieure de l’éminence du ganglion latéral. Cette incision doit s’étendre de la limite latérale de l’éminence ganglionnaire à la paroi médiale du rudiment cortical en développement.

Utilisez le scalpel pour rétracter le lambeau cortical créé par les deux incisions. Cela limite le risque d’endommager le cortex. Disséquez maintenant l’hippocampe en développement et l’ourlet cortical du céphalon médial.

Faites-le à partir de l’apex du néocortex où la surface corticale latérale rencontre la paroi interhémisphérique. Ensuite, faites une incision transversale le long de la limite séparant l’éminence ganglionnaire latérale du cortex en développement. Retirez tout tissu disséqué supplémentaire de la plaque.

Le cortex disséqué est maintenant préparé avec le côté méningé vers le bas. Pour transférer le cortex, préparez une boucle de fil de platine reliée à une pipette en verre à l’aide d’un chignon et le brûleur fait fondre l’extrémité de la pipette sur le fil de platine. Une fois assemblé, stérilisez la boucle de fil de platine et laissez-la refroidir.

Retirez l’excédent de média autour de l’explan X avec une aspiration douce. Laissez une petite quantité de solution à utiliser avec la boucle de fil. Ensuite, placez une membrane en polycarbonate d’un centimètre dans une parabole d’imagerie de quatre centimètres de diamètre.

Maintenant, à l’aide du côté de la boucle du fil de platine, retournez doucement le cortex de sorte que le côté méningé soit orienté vers le haut. Placez ensuite l’explan X au milieu de la boucle et, en utilisant les forces hydrostatiques intrinsèques, soulevez l’explan cortical X de la parabole. Placez ensuite délicatement l’explan sur la membrane en polycarbonate et soulevez la boucle de fil de platine.

Ensuite, chargez une pipette de 50 microlitres de LCR ou d’un autre milieu. Soulevez doucement la membrane et détectez le support en dessous. Bonjour, couvrez la parabole d’imagerie.

Placez-le dans un récipient secondaire humidifié et incubez à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Pour soutenir la prolifération continue et la croissance explanée, les volumes de collecte de LCR à partir de portées moyennes ont été calculés pour les souris et les rats de divers âges embryonnaires. Lorsque des échantillons purs de LCR ont été prélevés, le LCR peut être analysé à l’aide d’un certain nombre de techniques différentes, telles qu’une coloration à l’argent de quelques microgrammes.

Ce LCR provient d’une souris E 14,5. Les explants de 24 heures ont proliféré avec 100 % de LCR ont une histologie tissulaire similaire à celle des embryons de rongeurs au même âge gestationnel, comme le montre l’immuno-coloration. pH trois.

Un marqueur de division cellulaire est exprimé le long de la surface ventriculaire. Le marqueur B-R-D-U-A de la synthèse de l’ADN montre également une incorporation le long de la zone ventriculaire. Et d’une part, un marqueur neuronal est exprimé dans la plaque corticale en développement.

Avant d’entreprendre ces procédures, il est important de vérifier les politiques de votre établissement concernant les techniques que nous avons démontrées. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour étudier les signaux sécrétés dans le LCR en instruisant le rôle du cortex cérébral pendant le développement in vitro.