의 적용 체외 DNA 보호 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 DPS 활성으로 인한 라디칼 매개 DNA 손상의 감소를 시각화하여 DPS 단백질의 보호 효과를 체외에서 분석하는 것입니다. 이는 먼저 대장균 세포에서 DPS를 정제하고 여러 이온 교환 컬럼과 황산암모늄 침전을 활용하여 달성되며, 두 번째 단계로 정제된 DPS를 DNA에 첨가하여 단백질의 비특이적 DNA 결합 특성으로 인해 A-D-P-S-D-N-A 복합체를 형성할 수 있습니다. 다음으로 페리스 철과 과산화수소의 용액을 반응에 첨가하여 Fenton 화학을 통해 하이드록실 라디칼을 생성하여 DNA를 손상시킵니다.

얻어진 결과는 전기영동 후 agros gel에서 손상되지 않은 DNA 띠의 정량화를 기반으로 DPS의 존재로 인한 DNA 손상의 감소를 보여줍니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 시약 준비에 어려움을 겪을 것입니다. 이것은 철 침전물의 형성 또는 과산화수소의 자발적 붕괴와 같은 원치 않는 컴퓨팅 반응을 유발합니다.

이 방법은 산화 스트레스에 대한 DPS의 보호 활성에 대한 통찰력을 제공하지만 DNA 분해에 대한 다른 단백질 및 화학 물질의 영향을 정량화하는 데에도 적용할 수 있습니다. 이 방법은 식품 산업에서 사용하기 위한 세포 추출물의 항산화 특성을 결정하는 것과 같은 산화 화학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. DNA 보호 분석을 위한 필수적인 첫 번째 단계는 고순도의 DPS 단백질을 얻는 것입니다.

DPS 발현 및 정제 절차를 시작하기 위해, 대장균의 단백질 분해효소 결핍 균주를 DPS 단백질 인코딩 염기서열이 클로닝된 PET 벡터로 형질전환시킵니다. 적절한 항생제가 함유된 1리터 LB 배지의 플라스크 2개에 10ml를 접종합니다. 형질전환된 세포의 단일 군체에서 성장한 하룻밤 배양물 각각은 섭씨 37도에서 성장하면서 약 0.6의 OD 600으로 흔들립니다.

세포가 원하는 od에 도달하면 IPTG를 0.3 밀리몰 농도에 첨가하여 DPS의 발현을 유도하고 섭씨 37도에서 3-4시간 동안 배양하면서 6, 000 GS에서 15분 동안 원심분리하여 수확 세포를 흔듭니다. 우리는 세포 펠릿을 7.5 밀리리터의 DEAE 완충액에 현탁시키며, 이는 풀링된 세포 현탁액에 대한 프로테아제 억제제의 혼합물에서 유도된 세포 배양 1리터당 것입니다. 과발현된 TPS의 분해를 방지하기 위해 프렌치 프레스 프라임을 사용하여 무세포 추출물을 준비합니다.

DEAE 완충액 A의 20 밀리리터를 가진 프렌치 프레스는 그 후에 20 KPSI 원심 분리기에 표본을 두번 붕괴하고, 4 섭씨 온도에 35 분 동안 000 GS에 용해물을 분쇄한다. 상층액을 저장하는 불용성 입자를 명확히 하려면 DEAE 버퍼 a와 평형을 이룬 30ml DEAE SRO SEAL six B 컬럼에 무세포 추출물을 로드하여 흐름을 수집하기 시작합니다. OD two 80 신호가 기준선 이상으로 증가하기 시작하면 O od two 80 값이 기준선으로 돌아올 때까지 DEAE 버퍼 A로 컬럼을 세척하면서 흐름을 지속적으로 수집합니다.

플로우 스루. 결합된 DNA가 없는 DPS 단백질의 대부분을 포함해야 하며, 100% 완충액 B.This 용출액으로 컬럼을 세척하면 D-P-S-D-N-A 복합체와 기타 단백질을 포함하며 폐기할 수 있습니다. 다음 단계는 황산암모늄 침전을 통해 추가적인 오염 단백질을 제거하는 것이며 일반적으로 냉장실에서 수행됩니다.

풀링된 흐름의 부피를 결정한 후 교반하면서 섭씨 4도에서 10-20분 동안 건조 작은 입자 황산암모늄을 62% 포화까지 천천히 첨가합니다. 우물은 20, 4 섭씨 온도에 30 분 동안 000 GS에 원심 분리에 의하여 침전된 단백질을 제거한다. 상등액을 천천히 저장하십시오.

상등액 1밀리리터당 황산암모늄 227mg을 추가로 첨가하여 94% 포화도에 도달하고 20-30분 동안 저어줍니다. 이 높은 소금 농도에 완전한 평형 TPS가 침전된다는 것을 지키기 위하여는, 20에 분리기 에 의하여 DPS를 모으십시오, 4 섭씨 온도에 30 분 당 000 GS. Resus 현탁액 버퍼에 펠릿이 포함된 DPS를 재현탁하고 샘플 부피를 2.5ml로 조정합니다.

겔 베드가 25ml의 Resus 현탁액 버퍼와 평형을 이룬 PD 10 겔 여과 컬럼을 사용하여 완충액 교환을 통해 황산암모늄을 제거합니다. 2.5ml의 DPS 샘플을 PD 10 컬럼 상단에 바르고 흡수되도록 한 다음 흐름을 버립니다. 3.5ml의 Resus 현탁액 버퍼 원심분리기로 피하여 DPS를 수집합니다.

완충액은 섭씨 4도에서 10분 동안 16, 000GS에서 샘플을 교환했습니다. 불용성 성분을 제거하려면 6-10ml의 희석 완충액으로 샘플을 희석하여 염 농도가 DPS에 충분히 낮은지 확인하십시오. SP SPHEROS 컬럼에 결합하려면 SP 버퍼와 평형을 이룬 30ml SPHEROS 고속 유속 컬럼에 샘플을 로드합니다.

OD 2 80 트레이스가 베이스라인으로 돌아가고 플로우 스루를 버릴 때까지 SP 버퍼 A로 세척합니다. 0에서 100% 버퍼 B까지 150ml 선형 그래디언트를 실행하면서 2밀리리터 분수를 수집합니다. DPS는 약 50%B에서 급격한 피크로 용리되지만 10%의 변동이 가능합니다.

OD two 60 대 OD two 80 비율을 측정하여 elucian fractions의 DNA 오염 여부를 확인합니다. 분광 광도계를 사용하여, 비율은 elucian 분획이 15%SDS 페이지 젤에 달릴 때 전형적으로 약 0.7이어야 합니다. 젤은 약 19킬로달톤에서 하나의 밴드만 표시해야 합니다.

DPS를 집중하고 스토리지 버퍼로 교환한 후 지갑 DPS 분수를 풀링합니다. 원심 필터 장치를 사용하여 정제된 DPS를 분취하고 액체 질소에 동결하여 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 유전자 보호 분석은 여러 시약과 복잡한 병원체 체계로 구성됩니다.

신중한 시약 준비와 정확한 타이밍은 재현성을 위한 절대적인 요구 사항입니다. 피펫팅 테이블을 사용하면 이 절차 중에 단계와 부피를 추적하는 것이 좋습니다. 밀폐 바이알에 물 30ml를 계량하여 용액에서 산소를 제거합니다.

두 개의 주사기 바늘을 사용하여 10분 동안 질소로 물을 씻어냅니다(하나는 유체 안에, 다른 하나는 그 위에). 0.0168g의 황산철 헤타 수화물을 물에 첨가하여 2밀리몰 스톡 용액을 얻습니다. 바이알을 밀봉하고 질소로 5분 더 씻어냅니다.

그런 다음 섞습니다. 용액은 명확해야 합니다.노란색의 힌트가 감지되면 새 철 용액을 준비하십시오. 100 밀리몰의 과산화수소 용액을 만들어 얼음 위에 보관하고 자연 붕괴로 인해 빛으로부터 보호하십시오.

이 과산화수소 용액은 준비 후 약 1-2시간 동안만 사용하십시오. 실온의 수조에서 정제된 DPS의 eloqua를 빠르게 따르고 탁상용 피코 원심분리기에서 4, 000GS에서 10초 동안 얼음 원심분리기를 유지하여 원심분리 후 응집체를 침전시킵니다. 분광 광도계를 사용하여 농도를 측정한 다음 12 x 반응 버퍼를 사용하여 고농도 스톡에서 선형 DNA를 희석하여 마이크로리터당 100나노그램의 농도를 얻은 다음 최종 반응 부피가 12마이크로리터가 되도록 PCR 튜브에 충분한 물을 피펫으로 주입합니다.

다음으로, DPS와 혼합된 DNA의 스톡 샘플을 만들어 최종 농도가 PCR 튜브에 D-N-A-D-P-S 혼합물인 3마이크로몰 피펫이 되도록 합니다. 대조 튜브는 DPS가 DNA에 결합할 수 있도록 실온에서 15분 동안만 DNA를 배양합니다. 원하는 농도에 빠르게 도달할 수 있도록 2밀리몰의 황산제1철 용액을 충분히 첨가하고, 100밀리몰의 과산화수소 용액 1마이크로리터를 10밀리몰의 최종 농도에 첨가한 다음 실온에서 5분 동안 배양합니다.

Fenton 매개 분해 반응이 일어날 수 있도록 20%SDS 믹스 1마이크로리터를 추가하고 섭씨 85도에서 5분 동안 배양하여 D-P-S-D-N-A 복합체를 파괴하고, SDS를 불안정하게 만들고, DPS DNA 복합체를 파괴하고, DNA에 대한 원치 않는 겔 이동을 방지하여 정량화의 용이성을 향상시킵니다. 이제 얼음에서 1분 동안 배양한 다음 로딩 염료를 추가하고 전기영동 전이 아닌 전기영동 후 아테륨 브로마이드를 사용하여 DNA를 염색하기 위해 아가로스 젤을 로드합니다. 이것은 SDS가 겔의 아테륨 브로마이드 분포를 방해하는 것을 방지합니다.

SDS 페이지에서 분석한 DPS 정제의 중간 단계는 다음과 같습니다. 첫 번째 열은 무세포 추출물입니다. 두 번째 레인은 DEAE SPHEROS 컬럼의 흐름입니다.

세 번째 레인은 DEAE 열의 EIT입니다. 4번째 레인은 60% 황산암모늄 침전의 상등액입니다. 5번째 레인은 PD 10 컬럼에 의한 90% 황산암모늄 침전 및 완충액 교환 후의 DPS 샘플입니다.

그리고 6번째 레인은 풀링된 순수 DPS 분수입니다. SP 스페로스 컬럼 단백질 후. 분자량 마커는 7번째 레인에 있습니다.

각 레인 하단의 백분율은 이미지 정량화 소프트웨어에 의해 결정된 DPS 순도를 나타냅니다. 여기에 입증된 DPS의 정제 공정은 재현성이 매우 높으며 단백질 순도는 지속적으로 99% 이상입니다.SDS 페이지 겔에 다른 단백질이 가시 띠로 나타나지 않습니다. 정제된 DPS는 철이 Fenton 화학을 통해 과산화수소 분해를 촉매하고 반응에 존재하는 DNA를 직접 손상시키는 라디칼 종을 생성하는 DNA 보호 분석에 사용할 수 있으며, 대표적인 결과가 이 그림에 나와 있습니다.

모든 레인에는 100나노그램의 선형 5킬로베이스가 포함되어 있고, DNA 레인 1에는 DNA만 포함되며, 레인 2에는 1밀리몰의 과산화수소가 포함된 DNA가 포함되고, 레인 3에는 1밀리몰의 과산화수소와 166마이크로몰의 황산철이 포함된 DNA가 포함됩니다. 그러나 DNA는 손상되었다. 레인의 4-8개는 3개의 마이크로몰, DPSD 데머, 1밀리몰의 과산화수소를 함유하고 있으며 왼쪽에서 오른쪽으로 철 농도가 증가합니다.

DPS가 산화적 분해로부터 DNA를 보호한다는 것은 3열과 5열을 비교해 보면 알 수 있다. 철 농도가 증가함에 따라 DNA 분해가 전반적으로 증가하는 것도 명백합니다. DNA 보호 분석을 통해 얻은 결과는 이미지 퀀트와 같은 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 정량화할 수 있습니다.

이 그래프는 3개의 어세이에 대해 평균화된 이 정량화의 결과를 보여줍니다. 오차 막대는 전체적으로 높은 수준의 재현성을 얻었음을 나타냅니다. 일단 마스터하면.

이 기술은 최대 40개의 샘플에 대해 약 4시간 내에 수행할 수 있으므로 다양한 조건을 병렬로 특성화할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 시약을 정확하게 준비하고 각 단계의 시간을 가능한 한 정확하게 정하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 분석은 배양 시간에 매우 민감하기 때문에 이 비디오를 시청한 후에는 반응성 산화제 종에 의한 분해로부터 DNA를 보호하는 활성을 결정하기 위해 고순도 DPS 단백질을 생산하고 시험관 분석에서 특성화하는 방법을 잘 이해해야 합니다.