La barre stabilisatrice: Administration de l'alcool à mouches

L’objectif global de cette procédure est de mesurer les comportements induits par l’alcool chez la drosophile, à l’aide d’une configuration peu coûteuse et facile à assembler, bien adaptée aux recherches de premier cycle ou aux chercheurs. Nouveau dans les études circadiennes. Ceci est accompli en assemblant d’abord la barre anti-mouche, permettant des comparaisons simultanées de plusieurs groupes de mouches.

La prochaine étape de la procédure consiste à cultiver la drosophile dans des cycles d’obscurité clairs spécifiés et à collecter des mouches du même âge pour l’expérience. Ensuite, les mouches sont exposées à des concentrations définies de vapeur d’alcool et les données sont collectées. En fin de compte, la mesure de la perte de réflexe d’écriture ou de la sédation peut montrer des différences de sensibilité à l’alcool entre les groupes, soit en fonction de l’heure de la journée, soit de la génétique.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes d’observation sont difficiles à apprendre en raison des défis liés à l’observation du comportement et de la faible lumière rouge, et à la détermination des vols qui ont perdu leur réflexe d’écriture et de ceux qui ne l’ont pas fait. Assemblez d’abord la barre de mouche. Commencez par assembler le flux d’air.

Connectez un petit morceau de tube en silicone flexible à un robinet d’air de bâtiment ou à un aérateur d’aquarium pour fournir un flux d’air. Divisez le flux d’air avec un connecteur en Y. Connectez la première branche à un régulateur.

Il contrôlera la quantité totale d’air à travers le système. Connectez la deuxième branche à un connecteur rapide. Cela permettra d’interrompre l’Airstream si nécessaire sans affecter le flux d’air calibré

Ajoutez un connecteur en Y et connectez chaque tube de dérivation à un régulateur de débit d’air. Connectez ensuite chaque régulateur à un débitmètre d’air. Maintenant, sectionnez les pipettes en verre d’un millilitre et faites fondre un angle droit dans chaque section.

Ceux-ci fonctionneront comme des tubes coudés rigides dans la configuration. Insérez la pipette droite en verre pour l’entrée d’air par un trou et étendez-la dans le fluide jusqu’à un centimètre au-dessus du fond. Insérez une section de verre coudée dans l’autre trou jusqu’à ce qu’elle pénètre juste dans la bouteille.

Utilisez ces sorties pour joindre le flux d’air de chaque bouteille à un connecteur en Y. À l’aide d’un tube flexible, connectez les débitmètres d’air à la section droite d’une pipette. Ceux-ci serviront d’entrées d’air dans les deux flacons de solution.

Eau ou alcool, conservez les deux flacons de solution dans un bain-marie Réglez deux degrés au-dessus de la température de l’air ambiant. Arrêtez les bouteilles avec des bouchons en caoutchouc qui ont deux trous avec un tube en silicone. Fixez l’autre extrémité du Y à une bouteille à l’aide d’un bouchon en caoutchouc à deux prises.

Le flux d’air de ce flacon de mélange alimentera les flacons d’observation en alcool vaporisé et en eau. Séparez le flux d’air de sortie de la fiole de mélange deux ou trois fois pour obtenir quatre ou huit petits courants d’air. Un pour chaque flacon d’observation.

Continuez à utiliser un tube en silicone. Les flacons d’observation sont des flacons vides scellés par un bouchon en caoutchouc à deux trous, une entrée et une sortie pour la vapeur d’alcool. Les tubes en verre s’adaptent aux trous de bouchon.

Couvrez les extrémités du tube de verre avec un filet. Maintenez le filet en place à l’aide d’un petit morceau de tube en plastique souple. Insérez ce tube dans le premier trou jusqu’à ce qu’il s’étende sur environ la moitié de la longueur du flacon.

Si nécessaire, utilisez du ruban en téflon pour obtenir un ajustement parfait. Insérez le deuxième tube de verre avec le filet jusqu’à ce qu’il affleure le bord intérieur du bouchon en caoutchouc. Mélangez les fractions appropriées des deux Airstreams à travers de l’alcool ou de l’eau.

Surveillez en permanence la pression de l’air et effectuez les ajustements nécessaires pour maintenir le mélange souhaité d’alcool et de vapeur d’eau dans la bouteille de mélange. Pour ce genre d’expérience, assurez-vous toujours que la pièce est correctement ventilée. Pour minimiser les variations entre les répliques, la plus grande attention doit être accordée aux conditions d’élevage des mouches.

Les mouches doivent être élevées dans des conditions de faible encombrement avec une synchronisation très étrange afin que les mouches du même âge et de la même cohorte puissent être testées les unes contre les autres. À l’approche des mouches le crépuscule. Récupérez les animaux fraîchement enfermés et conservez-les pendant 24 heures dans des flacons de conservation contenant en même temps une petite quantité de nourriture à forte concentration de gélose.

Le lendemain, subdivisez les mouches collectées en cohortes d’environ 30 mouches à l’aide d’un aspirateur et transférez les cohortes dans des flacons frais pour tester la modulation circadienne du comportement. Préparez suffisamment de cohortes pour tester chaque condition à six points de temps régulièrement espacés le jour du test afin de tester le comportement de modulation circadienne. Maintenez également les mouches dans l’obscurité constante à 25 degrés Celsius pendant deux jours avant le test.

Quelle que soit la conception de l’expérience, au moins une heure avant le test comportemental, transférez les mouches dans la salle de comportement expérimental éclairée uniquement par une faible lumière rouge. Exécutez les expériences sous une faible lumière rouge afin que la photostimulation ne fausse pas les résultats. Avant l’expérience, faites circuler l’air dans le système pendant au moins 10 minutes et calibrez les flux d’air.

Sous les flacons d’observation. Placez une feuille de papier blanc pour augmenter la visibilité de la mouche avec un contraste supplémentaire. Une fois que le flux d’air s’est stabilisé, débranchez le dispositif de dégagement rapide et chargez une cohorte de 30 mouches dans chaque flacon d’observation.

Lors de chaque passage de la barre de mouche, testez chaque condition expérimentale. Cela augmentera la robustesse de l’expérience et minimisera l’impact des variations quotidiennes. Une fois que tous les flacons d’observation sont chargés, rebranchez le flux d’air et démarrez les minuteries.

Utilisez une minuterie pour garder une trace de la durée totale de l’exposition à l’alcool et utilisez l’autre pour compter des intervalles de cinq minutes tout au long de l’essai. Surveillez les flux d’air et effectuez les ajustements nécessaires pour qu’ils restent constants. Généralement, les flux d’air se stabilisent toutes les cinq minutes à l’aide d’une lampe rouge.

Comptez le nombre de mouches qui ont perdu leur réflexe d’écriture. Gardez la lampe à au moins 12 pouces des flacons. Appliquez un tapotement ferme sur la fiole et comptez combien de mouches ne parviennent pas à s’écrire en quatre secondes environ.

Ces mouches peuvent encore bouger leurs pattes et leurs ailes, mais elles ne pourront pas se redresser. Si la mouche ne bouge aucun membre, elle est complètement sédative. Cela peut être noté comme un critère différent d’un manque de réflexe d’écriture.

La session durera environ une heure, à la fin, comptera le nombre total de mouches dans chaque fichier en utilisant le protocole décrit. Une modulation circadienne de la sensibilité à l’alcool a été mesurée. L’absence de réflexe d’écriture a été mesurée à six moments : au cours du deuxième jour d’obscurité dans le canton S, l’heure de la journée a eu un effet significatif sur le temps.

La moitié des mouches n’ont pas réussi à s’écrire elles-mêmes. Le pourcentage de cantons de vols sous sédation après 40 minutes avec 30 % d’alcool. La vapeur a été mesurée à la TDM cinq subjective le jour et à la TDM 17 la nuit.

Il a été constaté que beaucoup moins de mouches étaient sous sédation pendant la journée subjective par rapport à la nuit. L’utilisation d’une série chronologique a illustré les différences de réflexe d’écriture et de sédation lorsque les mouches de Canton ont été comparées à des mouches porteuses de la mutation blanche 1 1 1 8. Dans le contexte du canton S, les mouches blanches 1 1 1 8 ont montré un meilleur réflexe d’écriture en réponse à la vapeur d’éthanol que le canton S. Des différences entre les mutants blancs 1 1 1 8 et les mouches de type sauvage ont également été trouvées dans le taux de sédation.

La différence est très probablement due aux niveaux modifiés d’ennemis biogènes avec la mutation blanche 1 1 1 8. Ainsi, il est nécessaire de contrôler les réponses comportementales dues à la mutation blanche 1 1 1 8 présente dans de nombreuses lignées transgéniques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’administrer de l’alcool aux mouches à l’aide de l’étable à mouches.

Il est essentiel que les mouches soient collectées de manière méthodique et que les observations dans la faible lumière rouge soient standardisées autant que possible.