Microinjection Stereotaxic של וקטורים ויראליים הבעת Cre recombinase כדי ללמוד את התפקיד של גני מטרה בהעדפות מקום אוויר קוקאין

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבטל באופן סלקטיבי את גני המטרה במהלך שלבים נפרדים של פרדיגמת העדפת המצב כדי לבחון את תרומתם להתנהגות זו לאורך זמן. זה מושג על ידי הזרקת מיקרו סטריאוטקסית ראשונה של הווקטור הנגיפי הקשור ל-eno רקומביננטי המבטא Cree recombinase. לאחר מכן, העכברים מורשים להתאושש בכלוב הביתי שלהם למשך 10 עד 14 ימים להפעלה מחדש של C מקסימלי.

השלב השלישי של ההליך הוא בדיקת העכברים בהעדפת מקום מותנית, כולל שלבי הכחדת הרכישה והחזרתם. השלב האחרון של ההליך הוא ביצוע בדיקה היסטולוגית של עכברים שהוזרקו מיקרו כדי לאמת מיקום נכון של מיקרו הזרקה. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות שינויים בהתנהגות רכישה, הכחדה או החזרה בתגובה לנוקאאוט של גנים באמצעות בדיקות התנהגותיות של העדפת מקום תנאי.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מערכת ההזדווגות CRE lock P, הוא שהיא מאפשרת תזמון ספציפי יותר וספציפיות אנטומית של נוקאאוט הגן באופן דיסקרטי, מה שמאפשר לחקור את אובדן הגן בכל שלב של ההתנהגות. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בהתנהגות ממכרת מכיוון שהיא כרוכה בהבנה טובה יותר של הבסיס הגנטי שעשוי לעמוד בבסיס האופן שבו חשיפה לרמזים הקשריים יכולה לעורר זיכרונות הקשורים לקוקאין שעלולים לעורר השתוקקות והישנות אצל מכורים. כדי להתחיל, הניחו כלוב עכבר עם מצעים על מנעול חום לחימום להתאוששות לאחר הניתוח.

הגדר סכין גילוח חשמלי לגילוח הראש ואתנול ויוד כדי לעקר את הקרקפת. השתמש באתנול 70% כדי לנגב את מוטות האוזניים ואחיזת הפה של התקפות הסטריאו באמצעות מזרק המילטון בנפח חמישה מיקרוליטר. צייר חמישה מיקרוליטר של וקטור ויראלי והגדר אותו במחזיק מזרק על התקפות הסטריאו.

הנח כרית חימום במיקרוגל או כרית חשמלית על התקפות הסטריאו לאחר הזרקת IP לעכבר של קוקטייל קטמין קסילזין. על פי פרוטוקול הטקסט, בצע צביטת זנב כדי לבדוק את רמת ההרגעה. לאחר מכן, גלחו את הראש בין האוזניים לעיניים והשתמשו באפליקטורים סטריליים מכותנה כדי לנקות את האזור בשטיפות לסירוגין של אתנול ויוד.

לאחר מכן העבר את העכבר למשטח המחומם בסטריאו מתקף אפס. מוט השיניים ומוט האוזן מתקשים ומקבעים את שיני העכבר במוט השיניים, מבריגים את הלוע ואת מוטות האוזניים. אם נצפתה תנועה כלשהי או תנועת שפם.

יש לתת מנת דחף של קוקטייל קטמין קסילזין. לאחר מכן יש לשמן את העיניים כדי למנוע מהן להתייבש. לאחר מכן, בעזרת חיתוך אזמל, פתחו את הקרקפת ממש מאחורי האוזניים.

הניחו קליפסים של בולדוג בפינות הקרקפת כדי לקלף את העור מהגולגולת. לוודא ש-Bgma ו-Lambda נראים בקלות. ודא שהתפר מבגמה ללמבדה מיושר ומקם מחדש את הראש במידת הצורך.

לאחר אישור שהגדרות התקפת הסטריאו מאופסות, הנח את קצה המחט במקומו ב-bma. מדוד את הקואורדינטות האחוריות המדיאליות הגביות, הגחוניות והקדמיות הן עבור BMA והן עבור למבדה. לאחר מכן כוונן את הראש עד שהקואורדינטות הגחוניות עבור BMA ולמבדה יהיו בטווח של 0.02 מילימטרים זה מזה.

מרכז מחדש את קצה המחט על bgma, ומנקודה זו נע בכיוון האחורי הקדמי לקואורדינטה הרצויה. לאחר מכן, קדחו קידוח בקואורדינטה הרצויה. בדיקה שהמחט מסוגלת להיכנס ללא הפרעה על ידי הגולגולת, ואז להוריד את המחט לקואורדינטת הגחון הרצויה.

לאחר השגת הקואורדינטה, טבלו 0.015 מילימטרים מתחתיה למשך כ-10 שניות כדי ליצור כיס קטן לווקטור הנגיפי בקצב של כ-0.1 מיקרוליטר לדקה, הזריקו את הנפח הרצוי של הווקטור הנגיפי לאחר המתנה של שלוש דקות עד שהווקטור הנגיפי יתפזר, הרימו את קצה המחט 0.015 מילימטרים והמתינו שתי דקות נוספות. בסיום ההזרקות יש למרוח שעוות עצם כדי לאטום את שני החורים ולאחר מכן לתפור את הקרקפת. לבסוף, יש למרוח חסימה עצבית על האזור הפצוע.

הסר את העכבר מהתקפות הסטריאו והנח אותו בכלוב חם על גוש חום כדי להתאושש למשך 45 דקות עד שעה. תן לעכבר להתאושש לפחות 10 ימים כדי לאפשר הפעלה מחדש מקסימלית. תן לבעל החיים מים ורכך מזון ובופרנורפין פעמיים ביום במידת הצורך לכאב לאחר ההחלמה, הנח עכברים בתא המרכזי של מנגנון העדפה של שלושה חדרים לתקופת הרגלה 62 עם דלתות גיליוטינה סגורות.

לאחר ההתרגלות, פתחו את דלתות הגיליוטינה ואפשרו לעכברים לחקור בחופשיות את כל שלושת החדרים למשך 1200 שניות. השתמש בתוכנת Med PC 4 כדי לתעד את זמן השהייה של בעל החיים בכל תא באמצעות הנחיות מפרוטוקול הטקסט. הקצה את העכברים לתאי מיזוג על סמך ביצועיהם במהלך המבחן המקדים.

במהלך שלושת הימים הבאים, הזרקו 10 מיליגרם לק"ג קוקאין במהלך סשן בוקר ושלבו אותם מיד בתא שהוקצה להם למשך 1200 שניות. החזירו את העכברים לכלובי הבית שלהם למשך ארבע שעות, ואז הזריקו להם מי מלח וכלאו מיד את העכברים בתא הנגדי למשך 1200 שניות. כדי לבדוק את הרכישה, הניחו את העכברים בתא המרכזי עם דלתות גיליוטינה סגורות לתקופת ההתרגלות ה-62.

פתח דלתות גיליוטינה ואפשר חקירה חופשית למשך 1200 שניות או הקלטה. הזמן המושקע בכל התאים מחשב את ההעדפה על ידי הפחתת משך הזמן המושקע בתא זוג המלח מכמות הזמן המושקע בתא זוג הקוקאין. לאחר ביצוע CPP על עכברים מוזרקים מיקרו, הם נחשבים כמי שרכשו העדפה לתא מסוים.

כאשר העדפת קוקאין מוגדרת כזמן שהושקע בתא זוגות הקוקאין, פחות הזמן המושקע בתא זוגות המלח גבוה משמעותית בהשוואה לציון ההעדפה הבסיסי. אם כקבוצת ביקורת עכברים שהוזרקו אינם מראים העדפה לתא או להצגה של זוג קוקאין, מיקום סלידה מאומת מיד באמצעות היסטולוגיה, ואותם עכברים עם מיקום שגוי מודחים מהמחקר. אם ההעדפה נרכשת בדרך כלל על ידי קבוצת הביקורת המוזרקת, הפרדיגמה מורחבת על ידי תחילת ההכחדה.

עכברים נחשבים כמי שכיבו את ההעדפה המושרה על ידי התרופה לתא מסוים. כאשר העדפת קוקאין על פני שני ימי הכחדה רצופים נמוכה משמעותית בהשוואה לציון העדפת הרכישה בשלב זה, ניתן להחזיר עם פריים של סם. אם ציון ההעדפה לאחר מתן התרופה הראשונית אינו ניתן להבחנה סטטיסטית מזה בעת הרכישה, אז אומרים שאותה קבוצה החזירה את ההעדפה המושרה על ידי התרופה לתא הזוגי של התרופה באמצעות PCR כמותי.

איור זה מדגים כי הגן המעניין למעשה נוק אאוט בעכברים שהוזרקו מיקרו בעקבות הזרקת מיקרו של RAAV Cree GFP לגרעין האקומבנס שיש להם איזופורם של תעלת סידן מסוג L, להקות CAV 1.2 של RAAV. אגרופים שהוזרקו על ידי קרי מראים ירידה משמעותית בביטוי הגנים בהשוואה לעכברים שהוזרקו עם A-A-V-G-F-P המוצג כאן. ניתוח אימונוהיסטוכימי של גרעין האקומבנס עבור GFP חושף מיקום דו-צדדי נכון של RAAV Cree המוזרק מיקרו לאחר הליך זה.

ניתן לבצע טכניקות אחרות כגון PCR כמותי בזמן אמת וגוף מערבי על מנת לענות על שאלות הנוגעות להשפעה של הפלה של גן על רמות הביטוי של גנים אחרים מעניינים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין טוב יותר כיצד לבטל באופן סלקטיבי גנים מטרה במוח העכבר באמצעות וקטורים ויראליים של מיקרו-הזרקה סטריאוטקסית על מנת לבחון באופן סלקטיבי את תפקידם של גנים אלה בהכחדת הרכישה והחזרת פרדיגמת העדפת מקום המצב.