Cre Recombinase Kokain Klima yeri tercihi Hedef Genlerin Rolü Eğitim için ifade Viral Vektörler stereotaksik Mikroenjeksiyon

Bu prosedürün genel amacı, zaman içinde bu davranışa katkılarını test etmek için koşul yeri tercihi paradigmasının ayrı aşamaları sırasında hedef genleri seçici olarak ablate etmektir. Bu, Cree rekombinazı eksprese eden rekombinant eno ilişkili viral vektörün ilk stereotaksik mikro enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, farelerin maksimum C reaktivasyonu için 10 ila 14 gün boyunca ev kafeslerinde iyileşmelerine izin verilir.

Prosedürün üçüncü adımı, fareleri, edinme neslinin tükenmesi ve eski haline getirme aşamaları da dahil olmak üzere şartlı yer tercihinde test etmektir. Prosedürün son adımı, doğru mikro enjeksiyon yerleşimini doğrulamak için mikro enjekte edilen farelerin histolojik bir incelemesini yapmaktır. Sonuç olarak, koşul yeri tercihi davranış testi yoluyla gen nakavtına yanıt olarak edinim, yok olma ve/veya eski haline getirme davranışındaki değişiklikleri gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin CRE kilit P eşleşme sistemi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, gen nakavtının ayrı ayrı daha spesifik zamanlamasına ve anatomik özgüllüğüne izin vermesi ve davranışın her aşamasında gen kaybının araştırılmasına izin vermesidir. Bu tekniğin etkileri, bağımlılık davranışının tedavisine kadar uzanır, çünkü bağlamsal ipuçlarına maruz kalmanın, bağımlılarda özlem ve nüksetmeye yol açabilecek kokainle ilgili anıları nasıl tetikleyebileceğinin altında yatan genetik temeli daha iyi anlamayı içerir. Başlamak için, ameliyat sonrası iyileşme için ısıtmak üzere bir ısı kilidine yataklı bir fare kafesi yerleştirin.

Kafayı tıraş etmek için elektrikli bir tıraş bıçağı ve kafa derisini sterilize etmek için etanol ve iyot ayarlayın. Beş mikrolitrelik bir Hamilton şırınga kullanarak kulak çubuklarını ve stereo saldırıların ağız tutuşunu silmek için% 70 etanol kullanın. Beş mikrolitre viral vektör hazırlayın ve bir şırınga tutucusuna yerleştirin Stereo saldırılarda.

Fareye bir ketamin ksilazin kokteyli IP enjeksiyonu enjekte ettikten sonra stereo saldırıların üzerine mikrodalgada bir ısıtma yastığı veya elektrikli ped yerleştirin. Metin protokolüne göre, sedasyon seviyesini kontrol etmek için bir kuyruk tutamağı yapın. Daha sonra, başınızı kulaklar ve gözler arasında tıraş edin ve alanı alternatif etanol ve iyot yıkamalarıyla temizlemek için steril pamuk aplikatörleri kullanın.

Ardından fareyi stereo saldırılar sıfırdaki ısıtmalı pede aktarın. Diş çubuğu ve kulak çubuğu ölçeklenir ve farenin dişlerini diş çubuğuna yerleştirir, namluyu ve kulak çubuklarını vidalayın. Herhangi bir kıpırdama veya bıyık hareketi not edilirse.

Bir takviye dozu ketamin ksilazin kokteyli uygulayın. Ardından kurumasını önlemek için gözleri yağlayın. Ardından, bir neşter kesimi kullanarak, kafa derisini kulakların hemen arkasına açın.

Cildi kafatasından soymak için kafa derisinin köşelerine bulldog klipsleri yerleştirin. Bgma ve Lambda'nın kolayca görünür olduğundan emin olmak. Bgma'dan Lambda'ya olan sütürün hizalandığından emin olun ve gerekirse başı yeniden konumlandırın.

Stereo saldırı ayarlarının sıfırlandığını onayladıktan sonra, iğne ucunu bma'da yerine yerleştirin. Hem BMA hem de lambda için dorsal, ventral, medial, lateral ve anterior, posterior koordinatları ölçün. Ardından, BMA ve lambda için ventral koordinatlar birbirinden 0,02 milimetre uzakta olana kadar kafayı ayarlayın.

İğne ucunu bgma üzerinde yeniden ortalayın ve bu noktadan itibaren ön arka yönde istenen koordinata doğru hareket edin. Ardından, istenen koordinatta bir sondaj deliği açın. İğnenin kafatasından kesintisiz olarak geçip geçemeyeceğini kontrol edin, ardından iğneyi istenen ventral koordinata indirin.

Koordinata ulaşıldığında, viral vektör için dakikada yaklaşık 0,1 mikrolitre hızında küçük bir cep oluşturmak için yaklaşık 10 saniye boyunca 0,015 milimetre altına daldırın, viral vektörün yayılması için üç dakika bekledikten sonra istenen viral vektör hacmini enjekte edin, iğne ucunu 0,015 milimetre kaldırın ve iki dakika daha bekleyin. Enjeksiyonlar tamamlandığında, her iki deliği de kapatmak için kemik mumu uygulayın ve ardından kafa derisini dikin. Son olarak, yaralı bölgeye sinir bloğu uygulayın.

Fareyi stereo saldırılardan çıkarın ve 45 dakika ile bir saat arasında iyileşmesi için bir ısı bloğu üzerindeki sıcak bir kafese yerleştirin. Maksimum yeniden etkinleştirmeye izin vermek için farenin en az 10 gün iyileşmesine izin verin. Hayvana su verin ve gerekirse günde iki kez yiyecek ve buprenorfini yumuşatın, iyileşme sonrası ağrı için, giyotin kapıları kapalı olarak 62. alışkanlık süresi için fareleri üç odacıklı bir yer tercih cihazının orta odasına yerleştirin.

Alışkanlıktan sonra, giyotin kapılarını açın ve farelerin 1200 saniye boyunca üç odayı da serbestçe keşfetmesine izin verin. Metin protokolündeki yönergeleri kullanarak hayvanın her odada geçirdiği zamanı kaydetmek için Med PC dört yazılımını kullanın. Fareleri, ön test sırasındaki performanslarına göre koşullandırma odalarına atayın.

Önümüzdeki üç gün boyunca, bir sabah seansı sırasında kilogram kokain başına 10 miligram enjekte edin ve bunları hemen 1200 saniye boyunca kendilerine tahsis edilen odada birleştirin. Fareleri dört saat boyunca ev kafeslerine geri koyun, daha sonra onlara salin enjekte edin ve fareleri hemen 1200 saniye boyunca karşı odaya sınırlayın. Edinmeyi test etmek için, fareleri 62. alışkanlık süresi boyunca giyotin kapıları kapalı olacak şekilde merkezi odaya yerleştirin.

Giyotin kapılarını açın ve 1200 saniye boyunca ücretsiz keşfe veya kayda izin verin. Tüm odalarda geçirilen süre, tuzlu su çifti odasında geçirilen süreyi kokain çifti odasında geçirilen süreden çıkararak tercihi hesaplar. Mikro enjekte edilen fareler üzerinde CPP yaptıktan sonra, belirli bir oda için tercih edindikleri kabul edilir.

Kokain tercihi, kokain çifti odasında geçirilen süre eksi tuzlu su çifti odasında geçirilen süre olarak tanımlandığında, temel tercih puanına kıyasla önemli ölçüde daha yüksektir. Bir kohort kontrolü olarak enjekte edilen fareler kokain çifti odası için bir tercih göstermezlerse veya göstermezlerse, histoloji yoluyla hemen bir kaçınma yerleşimi doğrulanır ve yanlış yerleştirilmiş fareler çalışmadan çıkarılır. Tercih normal olarak kontrol enjekte edilen kohort tarafından elde edilirse, paradigma yok olma başlangıcıyla genişletilir.

Farelerin, belirli bir oda için ilaca bağlı tercihi söndürdüğü düşünülmektedir. Birbirini izleyen iki yok oluş günü boyunca kokain tercihi, şu andaki satın alma tercihi puanına kıyasla önemli ölçüde düşük olduğunda, bir uyuşturucu prime ile eski haline getirilebilir. İlacın ana maddesinin uygulanmasını takiben tercih skoru, edinim sırasındakinden istatistiksel olarak ayırt edilemezse, bu kohortun, kantitatif PCR kullanarak ilaç eşleştirilmiş oda için ilaca bağlı tercihi eski haline getirdiği söylenir.

Bu şekil, RAAV Cree GFP'nin L tipi kalsiyum kanal izoformu, CAV 1.2 RAAV sürülerine sahip çekirdek akumbenlerine mikro enjeksiyonunu takiben mikro enjekte edilen farelerde ilgilenilen genin aslında nakavt edildiğini göstermektedir. Cree enjekte edilen yumruklar, burada gösterilen A-A-V-G-F-P enjekte edilen farelere kıyasla gen ekspresyonunda önemli bir azalma göstermektedir. GFP için nükleus accumbens'in immünohistokimyasal analizi, bu prosedürü takiben mikro enjekte edilen RAAV Cree'nin uygun bilateral yerleşimini ortaya koymaktadır.

Kantitatif gerçek zamanlı PCR ve Western bodying gibi diğer teknikler, bir genin yıkılmasının ilgilenilen diğer genlerin ekspresyon seviyeleri üzerindeki etkisine ilişkin soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, bu genlerin ediniminde rolünü seçici olarak test etmek için stereotaksik mikroenjeksiyon viral vektörleri kullanarak fare beynindeki hedef genlerin seçici olarak nasıl ablate edileceğini daha iyi anlamış olmalısınız.