Name: Intracellulaire enregistrement, le mappage des champs sensorielle, et la culture de neurones identifiés dans le Leech, Hirudo medicinalis /i (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-04T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Apprenez l'enregistrement intracellulaire et le mappage des champs sensoriels chez Hirudo medicinalis. Ces techniques d'électrophysiologie permettent d'étudier les neurones individuels et leurs connexions en neurosciences.

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Une. Préparation des électrodes et la solution saline <ol><li> Préparer une solution saline physiologique et des électrodes avant que l&#39;animal est disséqué. La solution de Ringer Leech se compose de ce qui suit: 115,3 mM de NaCl, 1,8 mM de CaCl2, 4,0 mM de KCl, 10 mM de Tris / acide maléique ou l&#39;HEPES. Ajuster le pH à 7,4. </li><li> Préparer un fil Ag-Cl par trempage d&#39;un fil d&#39;argent nettoyé dans une petite quantité d&#39;eau de Javel pour 20 min ou jusqu&#39;à ce que le fil a une finition gris foncé lisse. Laver le fil avec de l&#39;eau distillée avant utilisation. Ensuite, placez le fil dans un porte micropipette qui se branche sur l&#39;amplificateur. </li><li> Préparer une électrode de verre pointu de verre borosilicate aide d&#39;un extracteur de pipette. La résistance de l&#39;électrode devrait être de l&#39;ordre de 20 M. </li><li> Remblayer la pipette avec une solution d&#39;acétate de potassium 3 M et l&#39;insérer dans le support dans la micropipette. </li><li> Pour une électrode extracellulaire préparer une pipette en verre pointu tel que décrit ci-dessus, casser la pointe arrière parfrottant une autre pipette forte près du bord pointu. Puis tirer polir la pointe de sorte qu&#39;il ne se déchire pas les connecteurs. Électrodes extracellulaires plastique seront également travailler aussi longtemps que il ya un bon contact entre l&#39;électrode et le nerf. </li><li> Insérer l&#39;électrode extracellulaire d&#39;enregistrement dans un support de micropipette (avec fil d&#39;Ag-Cl) qui est équipé d&#39;un tube de caoutchouc et d&#39;une seringue pour aspiration. Utiliser la seringue pour aspirer une solution saline dans l&#39;électrode, au moins au niveau du fil d&#39;argent. </li><li> Configurez le matériel (amplificateur et relance isolateur) et les paramètres d&#39;enregistrement de logiciel en suivant le manuel de votre appareil d&#39;enregistrement de signal spécifique. Voir Leksrisawat et al. 22 pour voir les détails sur les équipements utilisés dans les expériences décrites ci-dessous. </li></ol> 2. Ventral Ganglion Dissection <ol><li> Disséquer la sangsue dans un grand plat en élastomère bordée silicone avec une solution de Ringer sangsue. Si l&#39;animal est étiré longitudinalement à elleplus facile d&#39;enlever la corde nerveuse ventrale (voir la figure 1A). </li><li> Avec # 10 ou # 11 taille scalpel, une incision longitudinale avec des coupes très peu profonds dans la ligne médiane ventrale. Vers le milieu 2/3rd de la coupe ventrale est représenté sur la figure 1B. Essayez de ne pas couper le bas noir (le sinus de sang ventrale) jusqu&#39;à ce que l&#39;animal est complètement ouvert et le sinus de sang est tendue sans plis. Cette sinus sanguin sur toute la longueur de l&#39;animal le long de la ligne médiane ventrale. La VNC est contenue à l&#39;intérieur de ce vaisseau sanguin. </li><li> Après que la peau a été coupée sur toute la longueur de l&#39;animal utiliser les ciseaux de l&#39;iris fines à entailler le sinus de sang (figure 2). Glissez une lame des ciseaux fins iris dans le cadre du sinus et soulever légèrement la lame pour le séparer du tissu nerveux. Couper le sinus de la longueur de la VNC tout en évitant les racines nerveuses, les nerfs segmentaires ou les connecteurs entre ganglions. </li><li> Ensuite, enlever une partie de la corde nerveuse ventrale parcouper les racines distales à l&#39;endroit où le vaisseau sanguin se joint à la racine. Répétez ce processus pour chaque ganglion le long de la longueur de la corde nerveuse ventrale. </li><li> Transférer un segment d&#39;un ou de deux noyaux à une petite boîte de Pétri. Les ganglions ou le seul ganglion doit être épinglé tendue avec un peu de mou. </li><li> Broche les connecteurs et les racines de sorte que la gaine ganglion gliale est légèrement étirée pour empêcher les corps cellulaires des neurones de se déplacer lorsque empalant à travers la gaine et gliales dans le neurone d&#39;intérêt. Les repères doivent être placées à travers le sinus noir pour les racines et dans le milieu des deux connecteurs pour minimiser les dommages des axones (figure 3). </li><li> Placez la boîte de Pétri avec la préparation sous le microscope et le fixer avec de la cire au fond de la boîte pour empêcher le mouvement. </li><li> Concentrer soigneusement le faisceau de lumière en utilisant un miroir et d&#39;un condenseur de lumière pour voir les neurones comme dans la figure 4A (schématiquement représenté sur la figure 4B </strong&gt;). Remarquez les deux grandes cellules Retzius dans le centre du ganglion. </li><li> Pour effectuer un enregistrement intracellulaire du Rz, T, P, et N neurones, placer soigneusement la pointe de l&#39;électrode sur la cellule d&#39;intérêt et abaisser doucement jusqu&#39;à ce que la pointe d&#39;une fossette se voit dans la gaine gliale. </li><li> Appuyez sur le support ou manipulateur électrode (très attentivement) de sorte que la pointe de l&#39;électrode &quot;pops&quot; dans la cellule d&#39;intérêt. </li><li> Injecter des impulsions de courte durée (30 à 40 msec) de courant positif (1 à 10 nA) dans la cellule pour évoquer des potentiels d&#39;action. </li></ol> 3. La culture de neurones du ganglion Préparation ventrale <ol><li> Epingler la face ventrale de ganglions dans un plat propre contenant de la L-15 avec du sérum de veau foetal (SVF) (figure 3). Epingler les racines de sorte que les noyaux sont légèrement étiré comme ci-dessus pour les enregistrements intracellulaires. Avec des ciseaux fins, entaille la capsule gliale à une extrémité, glisser une lame de ciseaux sous la capsule, puis couper à travers la capsule glialecomme représenté sur la figure 5A. </li><li> Ajouter 100 ul aliquote de collagénase / Dispase le plat et le placer sur un agitateur pendant 15 min. Examiner les cellules en déplaçant le milieu de culture autour des corps cellulaires exposées. Remettre les cellules à l&#39;agitateur pendant 15 minutes, ou plus longtemps jusqu&#39;à ce que les cellules sortent avec aspiration minimal. </li><li> Utiliser une pipette fixée à une seringue pour extraire en douceur les cellules du ganglion. Feu polir l&#39;extrémité de la pipette de sorte qu&#39;il est légèrement plus grand que le diamètre du corps de la cellule. Pour les cellules Rz dans une sangsue de l&#39;adulte, le diamètre doit être d&#39;environ 50 um. </li><li> Préparer une série de pipettes de différents diamètres sans un filament comme cela diminue les risques de collage des cellules à l&#39;intérieur de la pipette. Conserver les pipettes dans une bouteille contenant 80% d&#39;éthanol (EtOH) en utilisant une boule de coton en bas pour protéger les conseils de l&#39;écaillage. N&#39;oubliez pas de laver la EtOH de la pipette avec le milieu avant d&#39;aspirer les cellules. </li><li> Après le traitement enzymatique, laver l&#39;enzyme milieu contenant de la L-15 (FCS) 2x. Identifier les cellules d&#39;intérêt et les tirer doucement dans la pipette en tirant la seringue (figure 6A). Remplir les cellules aspirées dans un autre plat qui contient de la L-15 (FCS). </li><li> Jusqu&#39;à présent, toutes les procédures sont non-stérile. Effectuez les étapes suivantes dans une hotte stérile. Placez 3-4 grosses gouttes de L-15 stérile (FCS) dans différents endroits à l&#39;intérieur d&#39;une boîte de Pétri stérile. </li><li> Introduire à la pipette les cellules dans l&#39;une des gouttes avant-mentionnés, les soufflant autour de la goutte pour les laver. Répéter ce en série dans trois ou quatre gouttes de milieu. </li><li> Placez les cellules dans une boîte de Petri propre rempli de L-15 (FCS). </li><li> Incuber les cellules pendant 1 à 24 h à la température ambiante. Ensuite, les cellules propres peuvent être plaqués. En laissant les cellules pendant quelques heures ou toute la nuit de la matrice extracellulaire se détache facilement. Plaquer les cellules immédiatement pour générer processus plus longs. </li><li> Utilisez substrat stérile pour recouvrir un micropuits di<html> sh et laisser sécher complètement (la nuit) avant la mise en culture des expériences. </li><li> Après que le plat a été revêtue, laver le plat doucement avec de l&#39;eau stérile, puis avec une petite quantité du milieu L-15. N&#39;oubliez pas d&#39;utiliser la solution de L-15 sans le FCS ajouté pour permettre aux cellules d&#39;adhérer à l&#39;antenne. Le milieu peut être légèrement modifié pour L-15 avec FCS après que les cellules ont adhéré au substrat. Si les cellules sont utilisés quelques heures après l&#39;étalement, puis de passer le milieu de la L-15 avec FCS n&#39;est pas nécessaire. </li><li> Placer les cellules à côté de l&#39;autre au moment de placage pour induire la synaptogenèse rapide (Figure 6B). Après 24 h mesure l&#39;activité physiologique de paires de neurones. </li><li> Utiliser des techniques électrophysiologiques intracellulaires pour enregistrer RP ou les réponses synaptiques dans les paires de culture de cellules (stimuler 1 neurone par une électrode et d&#39;enregistrement intracellulaire des réponses de la cellule apparié en utilisant une 2ème électrode intracellulaire). </li></ol>titre &quot;&gt; 4. ganglion-corps mur Préparation <ol><li> Epingler la face dorsale de la chute dans un plat en élastomère bordée tel que décrit ci-dessus. </li><li> Epingler la peau d&#39;un côté avec les racines de l&#39;autre côté du ganglion coupée (figure 7A, agrandie à la figure 7B) ou faire une fenêtre sur la face ventrale de la chute sur un ganglion (figure 7C) avec toutes les racines à l&#39;organisme mur intact. </li><li> Après l&#39;obtention d&#39;un enregistrement intracellulaire stable dans l&#39;une des cellules sensorielles (T, P, N) utiliser une petite tige de verre qui a été poli feu de toucher légèrement la peau dans le même segment. Si le neurone en cours d&#39;enregistrement est une cellule à partir de N alors plus de pression devra être appliquée sur la peau. Dans la plupart des cas, la cellule N ne répondra si la peau est pincée avec des pincettes. Pour cette raison, ces cellules devraient être jugés dernier que l&#39;on pourrait endommager la peau ou déplacer le recodage intracellulaire en perturbant la préparation dans une telle manière. </li><li> Il faut êtreen mesure d&#39;esquisser rapidement la peau et ganglion avec des détails assez grande pour que la carte de l&#39;endroit où un touché peut être utilisé pour déterminer le champ récepteur d&#39;un neurone particulier. Après l&#39;enregistrement du plus grand nombre de cellules T et P que possible sur les deux côtés d&#39;un ganglion essayer les N cellules. </li><li> Afin d&#39;examiner si les neurones sensoriels ont des processus qui voyagent à travers les connecteurs de façon rostrale ou caudale, puis sur les racines dans le segment adjacent de la peau, les connecteurs entre ganglions peuvent être coupés et les champs récepteurs réexaminées en ce qui concerne la propagation de détection. Fondamentalement un examine s&#39;il ya eu des pertes dans le domaine réceptif. </li></ol> 5. L&#39;injection de colorants fluorescents <ol><li> Préparer un ganglion de sangsue tel que décrit ci-dessus. </li><li> Remplir une micro-électrode avec une solution de Lucifer jaune-CH (3,0%) et du chlorure de lithium (300 mM). </li><li> Empaler une des cellules sensorielles ou cellules Rz sur la face ventrale du ganglion comme décritci-dessus. </li><li> Injecter un colorant dans la cellule par passage d&#39;un courant négatif (3NA) à travers l&#39;électrode pendant 15 min. Régler la durée d&#39;impulsion de 100 ms et la fréquence de 2 Hz. </li><li> Visualiser les neurones de teinture remplis par l&#39;excitation du colorant avec une lampe au mercure et un jeu de filtres FITC / GFP. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Le but de cette série d&#39;expériences était de 1) pour enseigner et exposer les principes fondamentaux d&#39;enregistrements intracellulaires de neurones identifiables et 2) de reconnaître les formes caractéristiques des signaux électriques qui peuvent découler de ces types de neurones particuliers à l&#39;aide de sangsues pour adultes. Il ya une riche histoire des enquêtes en utilisant la chute des enquêtes neurophysiologiques et de la recherche est en cours dans le traitement des questions de circuits neuronaux et la régulation des gènes au cours du développement ainsi que lors de la réparation synaptique et la régénération 10. Neuromodulation, notamment par des voies d&#39;amines biogènes, a également été une direction de recherche fructueuse dans la chute. En ajoutant de la dopamine et d&#39;autres agents pharmacologiques sur le système nerveux à travers la solution saline, il a été montré que la dopamine module réseaux neuronaux impliqués dans 23 les schémas moteurs et pour l&#39;analyse du comportement de prise de décision 24,25. Cette approche expérimentale est un simple (et peu coûteux) façon d&#39;intégrer la modulation dans le laboratoire d&#39;enseignement, et en ajustant la composition ionique de la solution saline est un moyen efficace d&#39;enseigner les équations de Nernst et Goldman-Hodgkin-Katz. Pour avoir du succès avec les préparations ganglionnaires il est important d&#39;avoir le ganglion tendu avant de tenter de percer un soma avec une électrode intracellulaire. Sinon, le soma se déplace lorsque l&#39;on pousse sur le paquet gliales. En outre, lorsque le ganglion dégainage pour enlever les neurones de la culture, d&#39;éviter la région d&#39;intérêt lors de la coupe à travers le ganglion si somas ne sont pas endommagés, ils sont supprimés. En outre, l&#39;incubation excessive dans les enzymes peut entraîner les neurones étant trop fragiles pour être enlevé. Il nécessite quelques essais et erreurs pour atteindre un temps d&#39;incubation idéal parce que chaque série d&#39;enzymes est légèrement différent dans leurs actions. Une enquête plus poussée pour optimiser les milieux de culture pourrait améliorer cette technique. VariUO facteurs, tels que la présence d&#39;insuline, de sucres, ou des facteurs de croissance pourraient être examinés pour l&#39;entretien des cultures plus. Pour déterminer si les cellules conservent leur capacité à synthétiser des transmetteurs, tels que la synthèse de la sérotonine dans les cellules Rz, coloration au rouge neutre peut être appliquée à étiqueter processus sérotoninergiques. Invasion aussi la microglie à tissu lésé et la régénération peut être quantifiée par des taches nucléaires jours après une blessure. Bien que cette préparation a de nombreux avantages à offrir en examinant la régénération et la réparation, ainsi que les circuits neuronaux, l&#39;identification pharmacologique et moléculaire des différents sous-types de récepteurs au niveau des synapses n&#39;ont pas été pleinement caractérisé. Une bibliothèque de marqueur de séquence exprimée est disponible 26, et le génome de la sangsue médicinale est actuellement en cours d&#39;assemblage 27, mais la principale limitation à la sangsue par rapport à certaines préparations à base de modèle est la capacité de modifier le génome de gènes sélectifs dans des types cellulaires spécifiques. En embryons tsa restriction a été revue par l&#39;injection d&#39;ADN ou ARN double brin pour réguler l&#39;expression de gènes 28. La technique de canon à gènes a été récemment utilisée pour exprimer la connexine invertébrés (de innexin) de protéines dans les neurones de sangsue. Expression d&#39;un innexin de Hirudo verbana (HVE inx6) est suffisante pour la formation de jonctions lacunaires ectopiques dans la sangsue médicinale 29. La sangsue médicinale ou H. verveine que c&#39;était 30 est sûr de faire progresser notre compréhension de la physiologie et de l&#39;évolution des synapses électriques au cours des prochaines années.

La préparation de la chute est utile pour étudier la fonction des identifiable (sensoriel, moteur et inter-neurones dans le système nerveux central de l&#39;animal (SNC). L&#39;propriété utile de neurones de sangsue est que la forme de leurs potentiels d&#39;action et les propriétés biophysiques sont caractéristiques d&#39;un étant donné le type de cellule (par exemple P, N, T, Rz). outre neurones peuvent être retirés de l&#39;animal et on les cultive dans un milieu approprié dans lequel les cellules conservent leurs caractéristiques électriques aussi longtemps que 45 jours 1,2. Un net avantage du ganglion de sangsue pour apprendre à faire des enregistrements électrophysiologiques est que les cellules sont disposées de manière fiable et caractéristique dans le ganglion dans un modèle qui permet l&#39;identification des types cellulaires distincts de ganglion à ganglion et de l&#39;animal à animal. L&#39;emplacement unique et la morphologie des neurones dans sangsue ganglions ont été notées par Retzius dès 1891 3. Connaissance des el&#39;identité et la fonction d&#39;un neurone e est avantageux pour l&#39;étude des circuits neuronaux et pour faire des expériences avec un type cellulaire donné. En raison de la relativement grande soma des neurones dans un ganglion qu&#39;ils sont visibles avec un microscope à dissection, et les corps cellulaires peuvent être empalées sélectivement avec des microélectrodes pour l&#39;enregistrement de leurs propriétés électriques. Des colorants et des grosses molécules peuvent être injectés dans les cellules individuelles et les propriétés de canal étudié par patch-clamp. Courants ioniques qui donnent naissance aux différentes formes des potentiels d&#39;action des neurones dans les différentes caractéristiques ont été identifiées 4-7. Des enquêtes dans le modèle de l&#39;innervation et la ramification des neurones individuels dans le système nerveux central, les connexions synaptiques ont été reproduits dans la culture de neurones identifiés 2,8. Les études dans les ganglions de la chute ont permis de mieux comprendre le développement de circuits fonctionnels qui peut être mesurée avec électrophysiologie ainsi qu&#39;avec grose comportement animal des études. La sangsue CNS a aussi été une préparation précieuse pour les mécanismes impliqués dans la réparation et la régénération neuronale chez l&#39;animal entier et dans la culture 4-6,9-12 enquête. Dans le cerveau des mammifères est une tâche ardue pour expliquer le comportement en termes de propriétés et les connexions de neurones identifiés individuels. En principe, on peut espérer que l&#39;étude des systèmes moins complexes tels que la chute pourrait aider à définir des mécanismes de base utilisés chez les animaux supérieurs. Les connexions qui sont utilisées qui sous-tendent un modèle de natation 13,14 et la rythmicité du cœur 15 ont été bien caractérisés dans la chute. La capacité de certains neurones de sangsue à former à la fois la communication électrique et chimique est intrigante. Certaines connexions sont bidirectionnelles tandis que d&#39;autres sont unidirectionnels chimiquement mais bidirectionnel électriquement 7. Comprendre les connexions synaptiques dans l&#39;animal ainsi que de recréer la même type de connexions dans une boîte de culture sont des outils puissants pour enquêter sur la synaptogenèse 16-18 ainsi que le profilage pharmacologique de synapses 19. Les techniques d&#39;enregistrement et de stimulation intracellulaires décrites ici constituent une base pour les essais pharmacologiques et la recherche dans neuroéthologie et le développement. En outre, le segment chaîne nerveuse ventrale peut être disséqué avec un morceau de peau innervée. Avec la possibilité de garder un morceau de peau et les neurones en vie, les champs récepteurs sensoriels peuvent être sondés par l&#39;enregistrement de signaux électriques du corps cellulaire (c.-à-soma) des neurones sensoriels dans ganglion abdominal respective dans le SNC. Ainsi, on peut évaluer la sensibilité des terminaisons sensorielles en appliquant différents degrés de force sur la peau et la carte des champs récepteurs: légèreté, la pression et nuisible (douloureuse) stimuli 20,21. Un avantage de cette sangsue préparation ganglion-peau, c&#39;est un can dessiner anatomiquement la carte de champ récepteur et tracer les processus neuronaux au neurone identifié une fois que les réponses électriques sont enregistrées. Les trois expériences de sangsues décrites ci-dessous peuvent tous être remplis plusieurs fois avec un seul spécimen, ce qui en fait un module d&#39;enseignement rentable pour les laboratoires universitaires.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>182 silicone kit</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Tris/acide maléique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eau de Javel&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Pour chlorurer le fil d'argent</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>Pour ajuster le pH</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td>Pour ajuster le pH</td></tr><tr><td>Collagénase/Dispase</td><td>Boehringer Mannheim</td><td>269-638</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 avec L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>041-01415H</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Ready Systems Ag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>04-001</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose monohydraté</td><td>Merck</td><td>8342</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de gentamicine&amp;nbsp;</td><td>tout fournisseur</td><td></td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Gibco</td><td>043-0503H</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>3375</td><td>Acide libre, cristallin</td></tr><tr><td>Concanavaline A Type IV</td><td>Sigma</td><td>C 2010</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine hydrobromure</td><td>Sigma</td><td>P 7890</td><td>PM 15-30 000</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Plaque de micropuits, 60 x 10 &amp;mu;l</td><td>Falcon</td><td>3034</td><td>Fond plat, 10 par sachet</td></tr><tr><td>Matériel de dissection</td><td>World Precision Instruments</td><td>assortiment</td><td></td></tr><tr><td>Électrode intracellulaire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cage de Faraday</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Épingles pour insectes</td><td>Fine Science Tools, Inc</td><td>26001-60</td><td></td></tr><tr><td>Loupe binoculaire (100X)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lampe à fibre optique</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petit miroir réglable</td><td></td><td></td><td>Pour diriger le faisceau lumineux vers la préparation.</td></tr><tr><td>Électrodes en verre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS7095B5X</td><td>Boîte de 200, électrodes de succion</td></tr><tr><td>Micro-manipulateur</td><td>World Precision Instruments</td><td>MD4-M3-R</td><td>&amp;nbsp;Peut être fixé sur une base ou sur une tige métallique</td></tr><tr><td>Support surélevé pour préparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fil d'argent (10/1 000 pouce)</td><td>A-M Systems</td><td>782500</td><td></td></tr><tr><td>Ordinateur</td><td>toute entreprise</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur différentiel CA/CC</td><td>A-M Systems</td><td>Modèle 3000</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 26T</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td>27T</td><td></td></tr><tr><td>Étage de tête</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td></td><td>Fourni avec l'amplificateur CA/CC</td></tr><tr><td>LabChart7</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fils électriques</td><td>toute entreprise</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Outillage en verre&amp;nbsp;</td><td>fabriqué soi-même</td><td></td><td>Pour manipuler les nerfs</td></tr><tr><td>Câbles et connecteurs</td><td>toute entreprise</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes avec poire&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7</td><td>Boîte de 500</td></tr><tr><td>Béchers</td><td>toute entreprise</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cire ou pâte à modeler</td><td>toute entreprise ou magasins locaux</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stimulateur</td><td>Grass Instruments</td><td>SD9 ou S88</td><td></td></tr><tr><td>Embouts en plastique pour électrode de succion</td><td>quincaillerie locale (marque Watt&amp;rsquo;s)</td><td>&amp;frac14; pouce de diamètre extérieur x 0,170 pouce de diamètre intérieur</td><td>Couper en petits morceaux. Tirer à la flamme et recouper l'extrémité à la bonne taille.</td></tr></tbody></table>

intracellulaire enregistrement, le mappage des champs sensorielle, et la culture de neurones identifiés dans le leech, hirudo medicinalis</i

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

La chute d&#39;eau douce, Hirudo medicinalis, est un organisme modèle polyvalent qui a été utilisé pour traiter des questions scientifiques dans les domaines de la neurophysiologie, neuroéthologie, et la biologie du développement. Le but de ce rapport est de consolider les techniques expérimentales du système de chute en un seul article qui sera utile pour les physiologistes de l&#39;expertise dans d&#39;autres préparations du système nerveux, ou pour les étudiants en biologie avec peu ou pas d&#39;expérience de l&#39;électrophysiologie. Nous démontrons comment disséquer la chute d&#39;enregistrement intracellulaire de circuits neuronaux identifiés dans le ganglion. Ensuite, on montre comment les cellules individuelles de fonction connue peuvent être retirés à partir du ganglion être cultivées dans une boîte de Pétri, et la façon d&#39;enregistrer à partir de ces neurones en culture. Ensuite, nous montrons comment préparer un patch de peau innervée être utilisé pour mapper les champs sensoriels ou moteurs. Ces préparations de sangsues sont encore largement utilisés pour traiter les propriétés électriques de base de networ de neuronesks, le comportement, la synaptogenèse et le développement. Ils sont également un module de formation approprié pour les neurosciences ou la physiologie laboratoires d&#39;enseignement.

Des enregistrements intracellulaires de neurones sensoriels du ganglion de sangsue sont caractérisés par leurs traces distinctes tension-temps représentés sur la figure 4C. Le potentiel de membrane de la cellule au repos dans les cellules ganglionnaires de la sangsue en bonne santé est de -45 à -60 mV. Si potentiels sont plus petites (moins négatif) il faut changer l&#39;électrode de verre, ou si le potentiel est encore faible, passer à un autre segment de la chaîne nerveuse. Les potentiels d&#39;action spontanés avec une faible amplitude peuvent indiquer que l&#39;électrode se trouve dans un neurone moteur. Si cela se produit dans la paroi du corps d&#39;un ganglion injection de courant peut être utilisée pour déterminer si l&#39;une quelconque des neurone innerve les muscles sont encore attachés à la peau. Le neurone moteur anneau de monteur (AE) est sur ​​la face ventrale du ganglion (figure 4B) et il fera les anneaux (crêtes ou segments) à monter en activant le muscle érecteur anneau. Injection de courant dans les cellules sensorielles devrait évoquer potentiel d&#39;actions avec les formes d&#39;onde caractéristiques représentées sur la figure 4C. Si les signaux semblent différentes, il pourrait être dû à un pont asymétrique ou décalage compensation de capacité. Il faut consulter le manuel qui accompagne l&#39;unité d&#39;acquisition de signal pour plus de détails sur la façon d&#39;équilibrer le pont à l&#39;intérieur d&#39;une cellule. Notez que les artefacts de stimulation au début et à la fin des impulsions de courant de la figure 4C. C&#39;est ainsi que les objets semblent lorsque le pont est équilibré. Cultures primaires de neurones du ganglion de sangsue forment les synapses électriques et chimiques dans le plat. Au départ, les propriétés électriques des cellules en culture ne sont pas exactement les mêmes que in vivo. Cependant, après quelques jours, les impulsions sont presque indiscernables de ceux enregistrés dans le ganglion. Cela est illustré sur la figure 6C avec une paire de cellules Rz. Après 7 heures dans la culture de l&#39;amplitude des potentiels synaptiques était 1-2 mV. Après 56 h de culture sypotentiels naptic étaient plus de 10 mV (en haut de traces dans la figure 6C). La forme du potentiel d&#39;action modifie aussi après 56hr en culture. Dans les conditions décrites ces cellules sont viables pendant plusieurs jours. Communication intercellulaire peut être démontrée par la stimulation des racines nerveuses ou les connecteurs et l&#39;enregistrement de neurones dans le ganglion. La stimulation de ces nerfs génère potentiels synaptiques robustes et potentiels d&#39;action dans différentes cellules ganglionnaires. Des traces de la figure 8B ont été enregistrés à partir d&#39;une cellule dans un ganglion Retzius qui avaient été retirés de l&#39;animal et goupillé dans un plat. La trace noire a été évoquée par un stimulus subliminal appliqué avec une électrode extracellulaire au conjonctif. L&#39;augmentation de la tension de stimulation a provoqué la cellule pour déclencher un potentiel d&#39;action (trace rouge). Colorants ou la peroxydase de radis cheval fluorescent peut être injecté dans ces cellules pour étudier leur morphologie. Lucifer jaune a été injecté dans un Rzneurone en faisant passer un courant à travers l&#39;électrode négative. Une alternative consiste à injecter à l&#39;aide du colorant bouffées de pression d&#39;air. Figure 9A montre le colorant a commencé peu de temps après l&#39;injection. Trente minutes plus tard, le colorant avait déjà diffusé dans les racines nerveuses (figure 9B). Le type de colorant dépend de l&#39;application, par exemple les petites colorants de poids moléculaires qui peuvent passer à travers les jonctions communicantes sont utilisés pour identifier les synapses électriques. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig1.jpg" width="600px" /> Figure 1. . Ventrale dissection de la chute (A) L&#39;animal est complètement tombé face ventrale dans un plat en élastomère bordée rempli de sangsue saline (B) Une incision peu profonde couvrant la partie antérieure:. Axe postérieur est faite juste en dehors de la ligne médiane pour éviter d&#39;endommager le nerf cordon. Le sinus de sang noir (qui de contains le cordon nerveux ventral) peut facilement être vu. Notez l&#39;un ganglion exposé qui est blanc par rapport à la gaine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig2.jpg" width="600px" /> Figure 2. Dissection du sinus noir. Le vaisseau sanguin (flèche) doit être soigneusement coupé sur un côté pour exposer le cordon nerveux ventral (double flèche). Laissez segments de vaisseau sanguin intactes autour des racines segmentaires pour utilisation comme une poignée pour manipuler la corde nerveuse ventrale lors du transfert entre la dissection et des plats d&#39;enregistrement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 3"fo: contenu width = &quot;3 pouces&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50631/50631fig3.jpg&quot; width = &quot;400px&quot; /&gt; Figure 3. Section isolée de la corde nerveuse ventrale. Épingler la corde nerveuse ventrale par les fragments des vaisseaux sanguins restants sur les racines segmentaires et les extrémités des connecteurs segmentaires expose les ganglions pour les enregistrements électrophysiologiques. Un tendue étirement des ganglions permet de voir les corps cellulaires identifiables et permettra une pénétration plus facile de la gaine gliale d&#39;une électrode de verre pointu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig4.jpg" width="600px" /> Figure 4. Anatomie cellulaire du ganglion de sangsue. (A) Idéalement, les cellules Retzius (R) et d&#39;autres organismes de cellules de grande taille (P-presseure, T-touch, N-nociceptive, AE-anneau monteur) sera clairement visible si le microscope et condenseur de lumière sont mis en place correctement. (B) Représentation schématique des cellules du ganglion. De légères différences dans la localisation des somas auront lieu dans chaque ganglion en raison de la façon dont le ganglion est étiré et épinglé tendu. Potentiels (C) d&#39;action enregistrés à partir du soma de ces neurones ont des formes d&#39;onde caractéristiques. Ces pointes ont été évoqués par injection de courant positif dans la cellule (créneau superposant les traces tension-temps). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig5.jpg" width="600px" /> Figure 5. Dégainage du ganglion pour enlever les corps cellulaires individuels. (A) La gaine glialedoivent être soigneusement couper à travers le ganglion pour éviter d&#39;endommager les cellules d&#39;intérêt. La ligne rouge indique une coupe pour éviter de heurter le soma des neurones Rz. Ouverture de la gaine donne les enzymes digestives accéder à la matrice de tissu conjonctif. (B) les corps cellulaires saines exorbités sur le ganglion après la gaine gliale a été ouvert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig5highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig6.jpg" width="600px" /> Figure 6. La culture de neurones du ganglion de sangsue. (A) Les cellules sont aspirés du ganglion aide d&#39;une micropipette et transférés dans un plat contenant des milieux de culture. (B) Mise en place plusieurs cellules près de l&#39;autre va augmenter le taux de la synaptogenèse entre les neurones identifiables. Voici les étumps de deux neurones ont formé une synapse. (C) Les neurones en culture exposition légèrement différentes des propriétés électriques. Les meilleurs traces montrent potentiels synaptiques évoqués par la stimulation de la cellule adjacente 7 h et 56 h après que les cellules ont été étalées. Les traces de fond ont été évoquées en injectant un courant directement dans l&#39;une des cellules Rz. Notez l&#39;augmentation de l&#39;amplitude du potentiel synaptique et changer dans l&#39;action onde potentiel après 56 h de culture. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig6highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig7.jpg" width="600px" /> Figure 7. Le ganglion-corps préparation du mur de chute pour la cartographie des champs récepteurs. (A) Une approche consiste à éliminer toute une partie de la paroi du corps avec 1-3 ganglions. Ici, les racines d&#39;un côté ont bcoupe een et le ganglion a été épinglé sur le côté. (B) Un épinglé sur ganglion à plus fort grossissement. (C) Une autre approche est de créer une petite fenêtre dans la paroi du corps et enregistrer des ganglions intact tout en traçant un champ récepteur . (DG) Chacun des neurones sensoriels présente une caractéristique de réponse à un stimulus mécanique. (D) Une touche de lumière évoque l&#39;activité dans les cellules T, mais pas en P ou N cellules. (E) La réponse des lymphocytes T s&#39;éteint en réponse à plus forte stimuli, donnant ainsi à l&#39;activation de la cellule de P. Comme le stimulus devient plus fort N cellules devient actif (FG). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig7highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig8.jpg" width="600px" /> Figure 8. évoqué activité dans le ganglion de la sangsue. stimulation extracellulaire des connecteurs peut être utilisé pour entraîner la transmission synaptique dans la chaîne nerveuse. (A) Ceci est réalisé par fixation d&#39;une électrode d&#39;aspiration à l&#39;un des connecteurs et l&#39;application d&#39;une faible tension. L&#39;électrode de verre pointu (flèche) peut être vu empaler une cellule Retzius dans le ganglion. (B) des traces de tension-temps montrant l&#39;artefact de stimulation suivie par un synaptique potentiel (noir) et un potentiel d&#39;action (rouge). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig8highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig9.jpg" width="600px" /> Figure 9. L&#39;injection de colorant dans les neurones de sangsue (A). Jaune Lucifer peut être injecté dans le soma par passage de courant thropouah la microélectrode d&#39;enregistrement. Une lampe au mercure et FITC jeu de filtres peuvent ensuite être utilisés pour visualiser la fluorescence. (B) Dye a diffusé dans le Rz axones environ 30 minutes après l&#39;injection. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig9highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> .

Cet article décrit trois préparations du système nerveux à l&#39;aide de sangsues: enregistrement intracellulaire de neurones dans les ganglions ventrale, la culture de neurones de ganglions ventrale, et l&#39;enregistrement d&#39;un morceau de peau innervée de mapper les champs sensoriels.

Intracellulaire enregistrement, le mappage des champs sensorielle, et la culture de neurones identifiés dans le Leech, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

L'objectif général de cette procédure est d'apprendre à préparer le ganglion de sangsue pour l'enregistrement intracellulaire à partir de neurones individuels, à préparer un fragment de peau afin de cartographier un champ récepteur sensoriel et à cultiver des neurones de sangsue. Cela s'accomplit tout d'abord en utilisant de la glace pour anesthésier la sangsue, puis en la fixant en position dorsale vers le haut. L'étape suivante consiste à disséquer environ trois ganglions séparés et à les étirer pour l'enregistrement.La dernière étape consiste à empaler les neurones individuels et à enregistrer les potentiels d'action. Dans l'ensemble, le comportement du réseau neuronal peut être caractérisé en réalisant des caractérisations physiologiques des différents types cellulaires conjointement avec des expérimentations. Le principal avantage de l'utilisation de leches par rapport à d'autres préparations d'invertébrés simples comme les limaces S ou les crustacés réside dans le fait que les ganglions possèdent un peu plus de 400 neurones facilement accessibles, et que ces neurones peuvent rester actifs en culture pendant plusieurs jours.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la préparation de la peau et l'isolement de neurones individuels sont difficiles à maîtriser. On risque facilement d'endommager un ganglion qui pénètre un fragment de peau ou de lésiner les neurones lors de leur culture. Une question que l'on peut naturellement se poser en apprenant qu'on va visionner un film et lire un texte sur le système nerveux de la sangsue est : pourquoi diable quelqu'un travaillerait-il sur le cerveau d'un invertébré alors que le cerveau humain est tellement plus intéressant ?Et si vous deviez travailler sur un invertébré, pourquoi choisir la sangsue, un animal répugnant, sécrétant une abondante bave et aspirant du sang ? Eh bien, il existe plusieurs bonnes raisons à cela. La première est que la sangsue possède un système nerveux extrêmement simple par comparaison au nôtre.Et dans cet organisme, vous pouvez étudier des cellules nerveuses individuelles, observer comment elles sont connectées et comprendre comment ces connexions aboutissent au comportement d'un animal, d'une manière impossible à réaliser chez un animal plus complexe. Une autre raison est que la sangsue, introduite pour la première fois en neurosciences en 1960 par Stephen Koffler, offre des possibilités d'étudier des problèmes fondamentaux qui sont en réalité pertinents pour le fonctionnement de notre propre cerveau. Et il existe de nombreux exemples que je pourrais citer.L'une est que la majorité des cellules dans le cerveau, nos cerveaux, ne sont pas des cellules nerveuses, mais des cellules gliales, des cellules satellites, qui ont d'abord été étudiées chez la sangsue, puis, une fois leur fonctionnement connu chez cet organisme, on a pu vérifier s'il était similaire dans nos propres cerveaux, ce qui est effectivement le cas, et cela a également eu une importance pour de nombreux aspects cliniques. Mais la raison principale pour laquelle on travaille sur cet animal, comme vous le verrez dans le film, c'est qu'il possède un système nerveux remarquable. Le système nerveux est constitué d'une chaîne de ganglions, des groupes de cellules nerveuses, en nombre limité.Vous pouvez observer toutes les cellules et enregistrer leurs activités individuellement. Vous pouvez déterminer comment elles sont connectées, un peu comme l’étude d’un plan du métro parisien. C’est cette particularité qui rend la préparation si fascinante à manipuler, en association avec la possibilité de découvrir certains principes fondamentaux avant de commencer la dissection.Veillez tout d'abord à configurer le logiciel d'enregistrement et l'électrode d'enregistrement. Préparez-vous à disséquer une sangsue dans une grande boîte revêtue d'élastomère de silicone remplie de solution de Ringer en utilisant des épingles. Étirez l'animal sur le dos, face ventrale vers le haut, à l'aide d'un scalpel n°10 ou n°11.Effectuez une incision longitudinale à l’aide de coupes très superficielles le long de la ligne médiane ventrale. Évitez de couper le sinus sanguin ventral tant que l’animal n’est pas complètement ouvert et que le sinus sanguin n’est pas étiré sans plis. Le cordon nerveux ventral se trouve désormais à l’intérieur.Utilisez des ciseaux à iris fins pour inciser le sinus sanguin, glissez une lame des ciseaux sous le sinus et relevez légèrement la lame afin de séparer le sinus du tissu nerveux. Ensuite, coupez le sinus sur toute la longueur de la corde nerveuse ventrale (VNC) tout en évitant les racines nerveuses, les nerfs segmentaires ou les connexions entre les ganglions. Puis, retirez une partie de la corde nerveuse ventrale en coupant les racines au-delà du point où le vaisseau sanguin rejoint ces dernières.Transférez maintenant le ganglion dans une boîte propre remplie de solution saline et fixez-le par les racines nerveuses et les connexions. Utilisez cette préparation pour obtenir des enregistrements intracellulaires provenant des corps cellulaires des neurones sensoriels. Fixez les ganglions côté ventral vers le haut dans une boîte propre contenant du L 15.Avec du SFC fœtal, les racines doivent être légèrement étirées à l’aide de ciseaux fins. Faire une petite incision dans la capsule gliale à une extrémité, glisser une lame de ciseaux sous la capsule et la faire glisser transversalement à travers la capsule. Ensuite, ajouter 100 microlitres de collagénases dys dans la boîte et placer la boîte sur un agitateur pendant 15 minutes ; examiner ensuite les cellules en déplaçant le milieu de culture autour des corps cellulaires exposés.Replacer les cellules dans l’agitateurs pendant encore 15 minutes ou plus, jusqu’à ce qu’elles puissent être extraites du ganglion en appliquant une aspiration minimale à l’aide d’une pipette à embout poli au chalumeau, dont le diamètre interne est d’environ 50 microns, légèrement supérieur au diamètre du corps cellulaire. Pour libérer la MEC des cellules, ajouter quelques gouttes de milieu L 15 contenant du SFC et incuber les cellules pendant plusieurs heures à 24 heures à température ambiante. Lorsqu’elles sont prêtes, déposer les cellules côte à côte dans une plaque de microplaques revêtue d’un substrat.Avec le milieu L 15. N'utilisez pas de SFC. Après 24 heures, elles seront prêtes pour l'électrophysiologie et resteront viables pendant plusieurs jours.Initialement, les propriétés électriques ne sont pas exactement identiques à celles d'une préparation in vivo. Toutefois, après quelques jours, les impulsions sont presque indistinguables. Fixez la sangsue en position dorsale vers le bas dans une boîte revêtue d'élastomère, comme décrit précédemment.Ensuite, épingler la peau d'un côté avec les racines de l'autre côté du ganglion sectionné. Alternativement, pratiquer une fenêtre sur l'aspect ventral de la sangsue au niveau d'un ganglion, en conservant intactes toutes les racines reliant au corps. Après avoir obtenu un enregistrement intracellulaire stable dans l'une des cellules sensorielles, utiliser une petite tige chauffée et polie pour effleurer légèrement la peau dans le même segment contenant les cellules t et p.Le simple effleurement de la peau génère une réponse électrique. En revanche, pour les cellules terminales, une pression plus forte exercée par la tige sera nécessaire, et dans la plupart des cas, une cellule terminale ne répondra que si la peau est pincée avec des pinces. Par conséquent, afin de minimiser les dommages tissulaires potentiels, enregistrez les cellules N en dernier pour déterminer si les neurones examinés possèdent des prolongements à certains emplacements.Les connexions entre les ganglions peuvent être sectionnées et les champs récepteurs peuvent être réexaminés afin de détecter d'éventuelles pertes. Les enregistrements intracellulaires des neurones sensoriels dans le ganglion de la sangsue se caractérisent par leurs tracés temporels distincts. Leur potentiel de repos se situe entre -45 et -60 millivolts.Si la mesure est plus faible, une nouvelle sonde en verre ou une nouvelle préparation doit être utilisée. La présence de potentiels d'action spontanés d'amplitude réduite indique que la cellule pourrait être un neurone moteur. Dans la préparation de la paroi du corps ganglionnaire, une injection de courant peut être utilisée pour déterminer si le neurone innerve un muscle encore attaché.Par exemple, le motoneurone érecteur de l'anneau situé du côté ventral du ganglion provoquera l'élévation de l'œil annulaire. Si, après injection de courant, on observe un signal inhabituel, cela pourrait résulter d'un déséquilibre du pont ou d'une compensation insuffisante de la capacité parasite. Lorsque le pont est équilibré, des artefacts de stimulation apparaissent au début et à la fin des impulsions de courant après sept heures.Dans une culture primaire, des mesures ont été effectuées sur une paire de cellules réticulaires. L'amplitude des potentiels synaptiques était d'environ un à deux millivolts. Après 56 heures en culture, les potentiels synaptiques étaient supérieurs à 10 millivolts.La forme du potentiel d'action a également changé. Dans le même préparat, les racines nerveuses ou les faisceaux de connexion ont été stimulés. Le tracé noir a été obtenu par une stimulation sous-seuil appliquée à l'aide d'une électrode extracellulaire sur le faisceau de connexion.Le tracé rouge montre comment l'augmentation de la tension du stimulus a provoqué le déclenchement d'un potentiel d'action par la cellule. Une injection de jaune de lucifère dans une cellule rétinienne a été réalisée en appliquant un courant négatif à travers l'électrode. Peu de temps après l'injection, le colorant est resté localisé au niveau du soma.30 minutes plus tard, le colorant avait déjà diffusé dans les racines nerveuses après son développement. Cette technique aide les chercheurs dans le domaine de la neurobiologie à explorer le mécanisme sous-jacent des formes des potentiels d'action et à approfondir l'étude des circuits neuronaux. Elle contribue également à promouvoir la compréhension de la régénération et de la réparation dans des neurones identifiables.Cette vidéo démontre une série de techniques expérimentales. L'utilisation du leach pourrait s'appliquer à la synaptogenèse, à la neuromodulation ou à des aspects fondamentaux de la neurophysiologie.

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