Langzeit-Potenzierung der perforant Pathway-Gyrus dentatus Synapse in Frei Behaving Mäuse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Aufzeichnung von LTP in einem sich frei verhaltenden Mausmodell zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Mikroelektroden in den Perentenweg und den Gyrus dentatus implantiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die zu Beginn evozierten Reaktionen im Gyrus dentatus als Reaktion auf eine Einzelpulsstimulation des Perent-Signalwegs aufzuzeichnen.

Als nächstes wird die LTP nach einem Stimulationsprotokoll induziert. Der letzte Schritt besteht darin, postsynaptische Antworten aufzuzeichnen und mit den Ausgangswerten zu vergleichen. Letztendlich verbesserte Amplitude des Populationsanstiegs.

Messungen der evozierten Reaktion werden verwendet, um die sukzessive Induktion von LTP zu zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der in vitro Schnittpräparation besteht darin, dass das sich frei verhaltende Mausmodell die physiologisch relevanteste Plattform bietet, um die Wirkung von neuropharmakologischen Medikamenten oder genetischer Manipulation an Holzmodellen menschlicher neurologischer Erkrankungen zu testen. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie das Fell auf dem Kopf der Maus aus dem Bereich direkt über den Augen rasieren, so dass Sie direkt vor den Ohren darauf achten, die Schnurrhaare nicht zu rasieren, da sie Teil des sensorischen Systems des Mausfasses sind.

Reinigen Sie anschließend die rasierte Stelle zuerst mit Isopropylalkohol, dann mit Betadine und tragen Sie dann eine kleine Menge Mineralöl mit Wattestäbchen auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Übertragen Sie die Maus in das stereotaktische Gerät. Verwenden Sie Ratten-Earcuffs für Säuglinge anstelle von normalen Ohrstangen, um den Kopf des Tieres zu befestigen, indem Sie zuerst das linke Ohr auf den linken Earcuff montieren.

Schieben Sie dann das rechte Ohr vorsichtig auf die rechte Manschette, indem Sie mit einer Hand den Kopf des Tieres stützen und mit der anderen Hand die Ear Cuff vorschieben. Legen Sie danach ein Heizkissen unter den Körper des Tieres und stellen Sie es auf 86 Grad Fahrenheit ein, um die Körpertemperatur zu halten. Dann auf beidseitige Steifigkeit prüfen Durch den Versuch, den Kopf von Seite zu Seite zu bewegen, wird das Tier richtig auf dem stereotaktischen Rahmen montiert, wenn der Kopf starr ist und nicht von einer Seite zur anderen bewegt werden kann, sondern leicht auf und ab schwenken kann.

Legen Sie anschließend die Schnauze der Maus auf die Zahnstegbaugruppe und stellen Sie sicher, dass die Schneidezähne sanft, aber sicher in der Zahnöffnung des Zahnbalkens ruhen. Machen Sie mit einem sterilen Skalpell einen Schnitt in der Mittellinie, beginnend von der Mitte zwischen den Augen bis zur Mitte der Ohren. Achte darauf, dass das Skalpell in einem 45-Grad-Winkel gehalten wird und genügend Druck ausgeübt wird, um die darunter liegende Faszie zu durchschneiden, aber nicht durch den Schädel, da dies zu übermäßigen Blutungen führt.

Verwenden Sie dann Wattestäbchen, um die Faszien zu trennen, und gebogene Hämostaten, um den Schädel freizulegen. Die Schädelmarkierungen, bgma und lambda sollten deutlich sichtbar sein. Stellen Sie sicher, dass der Schädel des Tieres nivelliert ist, indem Sie die Zahnstange so einstellen, dass sich bgma und lambda in derselben DV-Position befinden.

Reinigen Sie als Nächstes den freiliegenden Schädel mit einer kleinen Menge steriler Kochsalzlösung und warten Sie zwei bis drei Minuten, bis der Schädel vollständig an der Luft getrocknet ist, bevor Sie fortfahren. Montieren Sie danach eine Nadel am linken stereotaktischen Arm. Zur Messung der DV-Positionen von bgma und lambda.

Stellen Sie sicher, dass sie innerhalb von 0,1 Millimeter voneinander entfernt sind. Wenn nicht, stellen Sie die Nasenleiste des stereotaktischen Rahmens nach oben und unten ein, um dies zu erreichen. Positionieren Sie dann die Nadel auf B bgma und zeichnen Sie die AP L-A-T-N-D-V-Messungen auf.

Achte darauf, dass die Nadel nur den Schädel berührt und ihn nicht durchdringt. Verwenden Sie einen Mausgehirnatlas, um die Koordinaten der Zielstrukturen relativ zu Lambda und bgma zu bestimmen. In unserem Fall sind es die mediale Perent Bahn im Gyrus angularus und Gyrus dentatus des Hippocampus.

Markieren Sie dann mit einem feinen Stift oder Bleistift diese Punkte auf dem Schädel. Als nächstes markieren Sie zwei weitere Punkte auf der kontralateralen Seite des Schädels. Diese Punkte, die als Boden dienen, sollten etwa drei Millimeter von der Mittellinie entfernt sein und in Längsrichtung zueinander liegen.

Entfernen Sie danach den Nadelmarkierer vom linken stereotaktischen Arm und ersetzen Sie ihn durch einen elektrischen Zahnbohrer, der mit einer stereotaktischen Halterung ausgestattet ist. Positionieren Sie den Bohrer über jedem markierten Punkt und stellen Sie kleine Bohrschalen mit einem Durchmesser von ca. 0,5 Millimetern her. Führen Sie beim Bohren häufig eine wiederholte Auf- und Ab-Kontrolle durch, um zu sehen, ob der Bohrer den Schädel durchdrungen hat, um die Gehirnoberfläche freizulegen und sanft, aber fest eine Schraubenelektrode in jedes der kontralateralen Löcher zu treiben, so dass sie die kortikale Oberfläche nur berühren, ohne sie zu durchdringen.

Diese beiden Schraubenelektroden dienen als Masse und Referenz. Anschließend montieren Sie die Stimulations- und Aufzeichnungselektroden in den Elektrodenhaltern am linken bzw. rechten stereotaktischen Arm. Verbinden Sie anschließend die Stimulationselektrodenanschlüsse mit einem elektrophysiologischen Stimulator mit Stromisolierung und den Aufzeichnungselektrodenanschluss mit einem elektrophysiologischen Differenzverstärker und dann mit einem digitalen Oszilloskop zur visuellen Inspektion der evozierten Reaktionen.

Verbinden Sie als Nächstes die Masse- und Referenzelektrodenanschlüsse mit dem Differenzverstärkerverstärker, senken Sie die Stimulationselektrode sanft und langsam auf den medialen Perran-Weg und die Aufzeichnungselektrode in Schritten von 0,5 Millimetern auf den Gyrus dentatus ab und verwenden Sie das Oszilloskop, um die evozierte Reaktion auf einen einzelnen Impulsreiz zu überwachen. Jedes inkrementelle Absenken der Elektroden senkt die Elektroden weiter ab, bis sie ihre jeweiligen DV-Zielpositionen erreichen und danach ein stereotypes Signal auf dem Oszilloskop beobachtet wird. Verwenden Sie den dentalen Acrylzement, um eine Kappe herzustellen, um die Elektrodenklemmen an Ort und Stelle zu halten.

Zahnzement, der die Haut berührt, sollte sofort abgewischt werden. Sobald der Zahnzement vollständig ausgehärtet ist, bringen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen in einen sauberen Nagetierkäfig und verwenden Sie eine Heizlampe oder ein Pad, um die Kerntemperatur zu halten. Überwachen Sie das Tier stündlich, bis es wieder zu Bewusstsein kommt.

Eine Injektion von Fuxin kann als Analgetikum verabreicht werden, nachdem sich das Tier fünf bis sieben Tage lang von der Operation erholen konnte. Platzieren Sie es in der Aufnahmeumgebung, die aus einem Faradayschen Käfig besteht, der mit schalldämmendem Material und einem fünfkanaligen rotierenden Kommutator ausgestattet ist, der die Elektrode verbindet, die zum Aufbau des stimulierenden Aufnahme-Setups führt. Lassen Sie das Tier ein bis zwei Stunden in der Aufnahmeumgebung akklimatisieren, bevor Sie die Elektroden an die Stimulations- und Aufzeichnungsinstrumente anschließen.

Stellen Sie als Nächstes die Stimulatorregler auf eine Ausgangsleistung von 400 Mikroampere ein. Zeichnen Sie die Amplitude von durchschnittlich 10 evozierten Reaktionen auf, wobei zwischen den Stimuli mindestens 10 Sekunden vergehen, und wiederholen Sie diesen Vorgang für 600 achthunderteintausendeintausendzweihundertundeintausendvierhundert Mikroampere. Verwenden Sie dann die in dieser Abbildung gezeigte Methode, um die Amplitude der evozierten Reaktionen zu quantifizieren.

Erstellen Sie eine Eingabe-Ausgangskurve, indem Sie die durchschnittliche Amplitude der evozierten Reaktion im Vergleich zur Stimulusintensität darstellen. Bestimmen Sie dann die Reizintensität, die 50 % der gemessenen maximalen Amplitude entspricht, und verwenden Sie diese Intensität für den Rest des Experiments. Erhalten Sie nun eine Basislinie, indem Sie die durchschnittliche Amplitude von fünf evozierten Reaktionen pro Minute für 15 Minuten aufzeichnen, wobei zwischen den Stimuli mindestens 10 Sekunden vergehen.

Geben Sie anschließend die Titanic-Stimulation an den medialen Perent-Signalweg ab. Überwachen Sie das Tier in der Zwischenzeit genau auf Anzeichen von Anfällen, einschließlich nassem Schütteln des Hundes. Wenn das Tier einen Krampfanfall hat, sollte der Versuch abgebrochen werden, und alle Daten dieses Tieres sollten aus den Studienergebnissen ausgeschlossen werden.

Nehmen Sie dann 30 Minuten lang die durchschnittliche Amplitude von fünf evozierten Reaktionen pro Minute auf. Vergleichen Sie danach diese Amplitude mit der zuvor erhaltenen Ausgangsamplitude, indem Sie die prozentuale Änderung gegenüber dem Ausgangswert berechnen. Hier ist die schematische Darstellung der relativen Lage der Elektroden auf dem Schädel der Maus dargestellt, und dies sind die typischen Spuren der evozierten Reaktionen sowohl vor als auch nach der Bildung.

Diese Abbildung zeigt die LTP-Induktion in der Synapse des medialen peripheren Pfads dentatus Gyrus einer sich frei verhaltenden Maus Nach der Beherrschung. Diese Technik kann in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Während Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, das Tier häufig zu untersuchen, um sicherzustellen, dass die Narkosetiefe erhalten bleibt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie stereotaktische Operationen durchführen, um Mikroelektroden chronisch zu implantieren, die anschließend zur Aufzeichnung der LTP in einer sich frei verhaltenden Maus verwendet werden.