La Xenopus Ovocytes Cut-ouvert vaseline Gap voltage-clamp Technique Avec Fluorimétrie

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir des enregistrements à faible bruit de courants ioniques et de courants de déclenchement à partir de canaux ioniques voltage-dépendants exprimés en cytes zap avec une résolution temporelle élevée de la cinétique de canal rapide. Ceci est accompli en injectant d’abord l’ARNm du canal ionique enregistré dans les ovocytes de grenouille. La deuxième étape consiste à créer des ponts de gélose en façonnant le tube capillaire, puis en remplissant le tube avec une solution de gélose contenant du sel.

Ensuite, la plate-forme ouverte est préparée pour l’expérimentation en plaçant tous les composants, y compris le site UO et les ponts d’agar, dans des endroits désignés. La dernière étape consiste à insérer la micro-électrode dans le site UO pour permettre les enregistrements par pince de tension. En fin de compte, le protocole d’enregistrement est utilisé pour montrer les courants ioniques des canaux ioniques situés dans la membrane ovocytaire.

Le principal avantage de la technique de la pince de tension à ouverture coupée est qu’elle permet des enregistrements stables à faible bruit d’une très grande population de canaux ioniques. Il permet également une résolution rapide de la cinétique des canaux. Une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car certaines étapes telles que le placement du site O, de la chambre supérieure et des ponts en gélose sont difficiles à apprendre.

Dans cette procédure, faites au moins six ponts de gélose en chauffant une extrémité d’un tube capillaire en boro silicate à feu moyen. Pour chacun d’entre eux. Assurez-vous que l’extrémité du tube capillaire se trouve dans la partie supérieure de la flamme bleue.

Une fois que le tube capillaire s’est réchauffé, utilisez la pince pour faire une courbure à 90 degrés. Le site de flexion doit avoir une courbure lisse plutôt qu’un coin abrupt, sinon il peut réduire considérablement le diamètre intérieur du verre, ce qui rend le remplissage plus difficile et augmente la résistance du pont. Ensuite, chauffez le tube capillaire à environ 25 millimètres de l’extrémité non pliée.

Faites un deuxième pli à 90 degrés à cet endroit dans la même direction que le premier pli. Une fois que les tubes capillaires ont refroidi, utilisez un coupe-verre à pointe de diamant pour couper les jambes du pont à environ cinq millimètres. Ensuite, insérez des fils de platine dans les tubes capillaires des trois ponts d’alimentation en courant.

Coupez tout excès de fil de platine afin qu’il n’y ait pas de fil exposé à l’extérieur du tube. Enfoncez le fil de platine plus loin dans le tube capillaire à l’aide d’un outil à pointe fine de sorte que le fil soit plus court d’un millimètre que le verre aux deux extrémités du tube capillaire. Ajoutez ensuite les ponts capillaires un à la fois à une solution de gélose préfabriquée avec les jambes vers le haut.

Une fois qu’il n’y a plus de bulles d’air ou de poches dans les ponts, récupérez les ponts de la solution Agar et placez les ponts sur une serviette en papier pour les faire sécher. Vous pouvez également remplir les ponts en poussant la solution de gélose à travers une seringue fixée à une petite pointe de pipette. Ensuite, préparez la plate-forme ouverte coupée sous un microscope à dissection en appliquant une petite quantité de vaseline autour du bord du trou sur la face supérieure de la chambre centrale et la face inférieure de la chambre supérieure avec un objet à pointe très fine.

Puis, à trois molaires, la solution de chlorure de potassium dans les fentes du collecteur contenant de l’argent, des pastilles de chlorure d’argent. Dans cette étape, installez la chambre supérieure sans site UO. Faites glisser la chambre supérieure vers le centre afin que les trous des deux chambres ne se chevauchent pas.

Remplissez ensuite toutes les chambres avec une solution externe et placez tous les ponts dans leurs chambres respectives. Après cela, assurez-vous que la commande externe et les deux pinces sont désactivées. Vérifiez la lecture du courant sur l’amplificateur et ajustez le P réglé à l’arrière de la tête de la protection de la baignoire sur le courant zéro à l’aide d’un petit tournevis.

Par la suite, mettez l’interrupteur de protection du bain de l’amplificateur sur actif. Ajustez ensuite le décalage GS sur la tête de protection du bain pour obtenir un courant zéro avec un petit tournevis, répétez l’opération entre actif et passif jusqu’à ce que les deux soient raisonnablement proches de zéro. Ensuite, retirez les extrémités du pont en gélose et la chambre supérieure.

Transférez un site UO dans la chambre du bain central à l’aide d’une pompe à pipette, assurez-vous que le site UO est positionné au-dessus du trou au centre du bain. Ensuite, retirez l’excès de solution externe du bain de fond à l’aide d’une pompe à pipette pour créer un joint entre le site UO et la surface du bain. Maintenant, placez la chambre de bain supérieure sur le site UO de sorte que le trou dans la chambre soit centré sur le site UO.

À l’aide d’un pouce, d’un majeur et d’une pince à épiler, appliquez lentement une pression sur la chambre jusqu’à ce qu’elle soit fermement pressée contre l’ovocyte afin de n’exposer qu’une petite partie de la membrane à la baignoire supérieure à travers le trou, puis ajoutez une solution externe aux bains supérieur et inférieur jusqu’à ce qu’ils soient presque pleins. Placez ensuite les jambes libres des ponts d’agar dans la solution externe de chaque bain. Assurez-vous que chaque pont repose à l’endroit correct de son bain.

Démarrez un protocole de test dans le logiciel d’enregistrement, vérifiez que le déplacement vertical de la section horizontale entre les deux pics de l’impulsion de test est inférieur ou égal à 100 nanoampères. Si la section horizontale présente un déplacement vertical supérieur à 100 nanoampères comme indiqué, augmentez l’étanchéité de la chambre supérieure sur le cyte. Par la suite, mettez l’interrupteur de protection du bain de l’amplificateur sur actif.

Ensuite, retirez la solution externe dans le bain de fond et remplacez-la par une solution de saponine. Une fois la solution de saponine ajoutée, observez l’impulsion de test répétitive sur l’écran de l’ordinateur. Si le pic du protocole de test diminue ou disparaît, cela indique qu’il y a une bulle en dessous.

Dans ce cas, le cyte a complètement remplacé la solution de saponine. Avec la nouvelle solution de saponine, le cyte a été permé. Lorsque la pente descendante du pic de courant dans le protocole de test diminue.

Une fois la cellule terminée, retirez la solution de saponine et remplissez le bain de solution interne. Arrêtez ensuite le protocole de test. Ensuite, vérifiez qu’il n’y a pas de contact possible entre les solutions dans différents bains et cristallisez le chlorure de potassium entre les puits du collecteur, car ceux-ci peuvent provoquer des courts-circuits et un comportement erratique.

S’il y a une solution, le contact entre les bains aspire les solutions en excès des deux bains. Pour le chlorure de potassium cristallisé. Utilisez la bouteille à eau pour laver le chlorure de potassium cristallisé, puis aspirez l’eau restante.

Ensuite, utilisez une seringue modifiée pour injecter trois molaires de chlorure de potassium dans une micro-électrode. Agitez la microélectrode plusieurs fois. Maintenant, montez l’électrode remplie de chlorure de potassium sur le bras du micromanipulateur en insérant le filament de fil dans l’extrémité ouverte de la micro-électrode.

Poussez l’extrémité de la microélectrode dans le support de filament et assurez-vous que l’électrode n’est pas desserrée. Après cela, serrez l’attache de l’électrode. Ensuite, faites pivoter le bras du micromanipulateur en position au-dessus des bains de cyte et serrez les pinces pour éviter tout mouvement supplémentaire du bras.

Abaissez l’électrode jusqu’à ce que la pointe de l’électrode brise à peine la surface du liquide dans le bain. Appuyez sur le bouton V un de la pince de tension cyte, puis ajustez le bouton de décalage V un pour réduire la tension V un à zéro. Effectuez le même réglage pour V deux.

La différence de potentiel V un moins V deux doit indiquer zéro millivolts sur l’affichage de la pince de tension. Après cela, continuez à abaisser l’électrode vers la zone visible du site UO dans le bain supérieur tout en regardant à travers le microscope. Une fois que la microélectrode est très proche du site UO, observez la lecture V un moins V deux pour voir quand l’électrode entre dans le site UO.

La tension V un moins V deux deviendra négative lorsque la micro-électrode entrera dans la cellule. À ce stade, ouvrez le protocole de collecte de données dans le logiciel d’enregistrement. Basculez l’interrupteur de la pince de tension de l’amplificateur de tension du site uoc sur le réglage de marche.

Ensuite, ajustez le potentiel pour correspondre à la commande en ajustant le bouton situé sur la platine de tête I. Commencez ensuite à enregistrer les courants en commençant le protocole d’enregistrement des données. Voici les traces d’impulsions de test sélectionnées.

Au cours de la perméabilité à l’ovocyte, l’augmentation de la constante de temps de décomposition observée dans les traces démontre une augmentation de la perméabilité de l’ovocyte. Cette figure montre le canal sodium de type sauvage résultant d’un bridage de tension ouvert. Voici les traces de courant enregistrées à partir de différents stimuli de tension.

La courbe de tension de courant illustrée ici représente la dépendance de la tension du courant de crête. Lorsque vous essayez cette technique, il est important de ne pas oublier d’avoir la pince de tension éteinte avant d’entrer dans la cellule et de désactiver la pince de tension avant de sortir de la cellule. Le non-respect de cette consigne peut endommager les ponts agricoles et ils devront probablement être remplacés.