Подготовка первичной Миогенный предшественников Cell / миобластов культур от базальной позвоночных линий

Общая цель этой процедуры заключается в культивировании миогенных клеток-предшественников костистых рыб для проведения миогенеза in vitro. Это достигается путем предварительного отделения эпаксальной мышцы от организма. Вторым этапом является механическая диссоциация изолированной ткани.

Затем ткань ферментативно диссоциируется для диспергирования нужных клеток. Заключительным этапом является нанесение изолированных миогенных клеток-предшественников на ламин в субстрат. В конечном счете, in vitro.

Миогенез используется для демонстрации влияния различных методов лечения на изменения в регуляции и экспрессии генов, экспрессии белков и изменениях фенотипа клеток. В этом видео будет показано, как настроить систему первичного культивирования из костучих миогенных клеток-предшественников. Визуальная демонстрация этой техники обязательна, так как некоторые шаги диссоциации могут быть трудными для изучения.

Правильная и адекватная диссоциация жизненно важна для выделения адекватной клеточной гранулы для последующего культивирования. Для начала подготовьте все среды и растворы, необходимые для процедуры. Далее соберите дополнительные предметы, необходимые для выделения тканей.

При необходимости предварительное автоклавирование. Обязательно подготовьте дополнительные материалы для каждого человека, помогающего в процессе вскрытия. Другие предметы, которые нужно иметь под рукой, включают 70% этанол, стерильные весы, конические пробирки объемом 50 миллилитров и лед на каждые пять граммов ткани, которую нужно препарировать.

Аликвотировать 25 миллилитров изоляционной среды в стерильную коническую пробирку объемом 50 миллилитров. После взвешивания и записи массы номера, трубки и помещают их на лед. Когда все будет готово, достаньте рыбу для использования в рассечении тканей и погрузите ее в 70% этанол на 30 секунд, прежде чем поместить ее на водоотталкивающую автоклавную бумагу прямо за эрлой, использует скальпель, чтобы сделать поверхностный неглубокий разрез, захватите кожу в месте разреза и потяните к хвосту, чтобы удалить чешую и кожу.

Далее иссекаем аксель быстро гликолитической белой мускулатурой рыбы с двух сторон. Избегание медленной окислительной красной мышцы, расположенной вблизи боковой линии. Поместите мышцы в изоляцию, среднюю и выбросьте оставшуюся рыбу.

Продолжайте собирать ткань до тех пор, пока во время диссекции не будет получено достаточное количество мышц, следите за тем, чтобы объединенная мышечная ткань оставалась на льду для поддержания жизнеспособности клеток. Для начала высыпаем одну трубочку мышечной ткани в стеклянную чашку Петри. Используйте два скальпеля вперед и назад, чтобы измельчить ткань до тех пор, пока тканевая жижа не будет легко удалена.

С помощью пипетки объемом 25 миллилитров поместите тканевую суспензию обратно в исходную пробирку. Повторяйте эти действия до тех пор, пока вся ткань не будет механически диссоциирована. Когда вся ткань будет обработана, центрифугируйте в течение пяти минут после этого, выбросьте надосадочную жидкость и промойте ткань свежей средой перед следующим раундом центрифугирования.

После тщательной промывки восстановите ткань на суспензии и инкубируйте с раствором коллагеназы в течение 60 минут при температуре 18 градусов Цельсия с легким покачиванием. По окончании инкубации центрифугируйте пробирки для гранулирования клеток. После двукратной промывки восстановите, подвесьте салфетку в промывочной среде.

Затем растирайте гомогенат ткани до тех пор, пока он относительно легко не войдет и не выйдет из пипетки объемом 10 миллилитров. Повторите этот процесс с помощью пятимиллилитровой пипетки, а затем еще раз с металлической канюлей 16-го калибра, прикрепленной к шприцу. После полной гомогенизации оболочьте ткань гранулами и сцедите надосадочную жидкость.

Повторно суспендируйте ткань в трипах в среде диссоциации и инкубируйте в течение 20 минут при температуре 18 градусов Цельсия. После этого поместите пробирки в центрифугу для короткого вращения после центрифугирования. Сцедите надосадочную жидкость в четыре равных объема изоляции.

Среда должна храниться при температуре четыре градуса Цельсия до оставшейся гранулы. Повторите только что продемонстрированные шаги трипов и диссоциации и объедините полученную надосадочную жидкость. С тем, что было собрано ранее.

Дозируйте окончательную смесь по 50 миллилитров, конические пробирки и центрифугу. После центрифугирования удалите надосадочную жидкость, стараясь не потревожить клетку. Пеллетной пипеткой внесите по два миллилитра полной среды в каждую пробирку.

Чтобы раствориться, соедините ресуспендированные клетки в одну коническую трубку объемом 50 миллилитров. Промойте каждую трубку одним миллилитром полной среды. Добавление полоскателя в бассейн с ресуспензионными ячейками.

Тритрируйте ткань металлической канюлей и шприцем от пяти до 10 раз. После фильтрации клеточной суспензии добавьте достаточное количество готовой среды, равное 50 миллилитрам, и центрифугуйте. Извлеките клетки, удалите надосадочную жидкость и добавьте пять миллилитров готовой среды.

После ресуспендирования удалите небольшой образец, чтобы определить количество жизнеспособных клеток. С помощью гемоцитометра. Удалите раствор ламинина с обработанных поли L лизином пластин.

Разбавив клетки до необходимой концентрации, нанесите их на подготовленные пластины и запечатайте. Поместите герметичные пластины в охлаждающий инкубатор с соответствующей температурой. 24 часа После посева миогенные клетки-предшественники или МПК должны быть заметно прикреплены к субстрату ламинина, при этом первоначально выглядя более компактными.

ПДК рыбок данио имеют морфологию, аналогичную радужной форели. В течение четырех дней культивирования миотрубки должны сформироваться в течение шести-девяти дней культивирования. В культуре показано, что МПК и миобласты экспрессируют мио D один.

По мере того, как миобласты дифференцируются в миотрубки, они начинают экспрессировать миогенин. Эти данные показывают пролиферацию клеток во время культивирования с использованием BRDU при инкорпорации. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как изолироваться и культура.

Миогенные клетки-предшественники различных видов рыб После его первоначального развития в клетке Моне. Этот метод проложил путь исследователям и специалистам по мышечной биологии к исследованию новых направлений в мышечной биологии и других организмах и других телио, таких как данио, а также других амфибий или амфибий, таких как Axel.