Rotulagem celular e injeção em Desenvolvimento embrionárias corações do rato

O objetivo geral deste procedimento é realizar a injeção de células mortas ou DNA em corações embrionários de camundongos. Para investigar a gordura celular ou manipular localmente a expressão gênica, realiza-se primeiramente a dissecção dos embriões de um camundongo prenhe e a exposição do coração embrionário. Em seguida, corante de DNA ou células são injetados na região-alvo de interesse no coração.

Então, após a incubação do embrião, o coração é removido e colocado em cultura. Por fim, o destino das células injetadas ou marcadas é determinado por microscopia. Em última análise, o destino de células injetadas, marcadas ou geneticamente modificadas é monitorado por microscopia confocal ou por microscopia de luz e fluorescência epiluminiscência, revelando a importância funcional de genes e células específicas durante o desenvolvimento cardíaco.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como transgênese em camundongo, é que podemos injetar localmente e com precisão células de laboratório ou modificar células geneticamente in vivo. Isso permite a investigação dessas células no ambiente adequado. A demonstração deste procedimento será feita por mim e por Emily Aar, estudante de doutorado de um laboratório.

Após preparar o equipamento, reagentes e soluções, conforme o protocolo descrito, colete embriões E 9,5 e E 10,5 de um camundongo grávido eutanasiado, utilizando primeiro etanol 70% para esterilizar o tórax, fazendo uma incisão mediana ventral para abrir o abdômen e retirar o cornete uterino antes de transferi-lo para PBS em temperatura ambiente. Após duas lavagens adicionais em PBS, transfira-o para uma placa de Petri contendo silicone. Com meio M 16, use alfinetes entomológicos para fixar o cornete uterino à camada de silicone, de modo que o lado vascularizado do útero fique voltado para baixo.

Em seguida, utilize pinças finas para cortar a superfície do útero e tampar o cório a um milímetro abaixo da superfície. Abra as paredes do cório e retire cuidadosamente o embrião no saco vitelino. Armazene-o em meio M16 a 37 graus Celsius antes da injeção celular para realizar as injeções.

Primeiro, utilize uma seringa Hamilton para encher um pipeta de vidro pela parte traseira com DNA ou células, e agite a pipeta para remover bolhas. Na ponta, coloque a pipeta no suporte de microinjeção e configure o injetor de acordo com as seguintes configurações. Em seguida, fixe o embrião no fundo de silicone através do saco vitelino sem tocar o embrião propriamente dito.

Em seguida, identifique a região do coração e abra o saco logo acima dessa região. Adicione quatro alfinetes ao redor do embrião para evitar qualquer movimento durante a injeção celular. Usando o micromanipulador ajustado para modo manual, posicione lentamente a ponta da pipeta em um ângulo de 45 graus acima do pericárdio, logo acima da região do coração a ser injetada.

Posicione a pipeta na região de interesse, acione a injeção e retire a pipeta o mais rapidamente possível. Certifique-se de que o coração esteja batendo adequadamente após a injeção de DNA ou células. Utilizando o protocolo de injeção descrito neste vídeo para estudar a transição de epitélio para mesênquima, um explante de VAC em E 9,5 foi injetado com um S-H-R-N-A que reduz a expressão de uma proteína necessária para a transição endotelial para mesenquimal de células endocárdicas. O embrião controle foi injetado com um vetor sem sequência de inserção, da mesma forma, células endoteliais pré-valvares derivadas de células HUES, expressando GFP sob controle do promotor SOX nove, foram injetadas na VAC em E 10,5, seguido de 48 horas de cultura de coração exposto.

Essas células adquirem marcadores de EMT, como a periostina, semelhante às células endocárdicas endógenas. As abordagens ex vivo demonstradas aqui são relativamente fáceis, mas limitadas a um acompanhamento de curto prazo máximo de 48 a 72 horas. No entanto, o procedimento de injeção guiado por ultrassom descrito no protocolo textual fornece uma abordagem tecnicamente mais desafiadora, mas com a possibilidade de acompanhamento prolongado, inclusive pós-natal, in utero.

A injeção in utero de corantes ou vetores virais para rotular células em regiões cardíacas específicas é apresentada aqui. Com este método, pode-se obter rotulagem específica de células epicárdicas com corantes fluorescentes ou vírus, e o método pode ser expandido com células ou substâncias injetáveis alternativas. Após este procedimento, pode-se realizar um método como a cultura de bryo, a fim de responder perguntas adicionais, como o efeito de longo prazo de um gene, de uma molécula ou de parâmetros de leitura prolongados, tais como a morfogênese tecidual após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biologia e genética do desenvolvimento cardíaco. Ela nos permite explorar o universo de novos genes, bem como investigar o destino celular humano no contexto embrionário apropriado. Isso é muito útil quando uma linhagem transgênica de camundongo não está disponível.