바이오 기반 산업을위한 원료로 담배 나무와 포플러의 평가에 대한 성적 증명서 및 대사 산물 프로파일

이 절차의 전반적인 목표는 시스템 생물학 지향 추정을 위해 담배 잎 물질의 대사 산물 및 RNA 염기서열 분석 데이터를 설정하고 최적화하는 것입니다. 이것은 먼저 발달 잎 시리즈의 생물학적 물질을 수집함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 후속 분석에 따라 적절한 용매를 사용하여 물질 추출을 수행하는 것입니다.

다음으로, 가스 크로마토그래피, 질량 분석 또는 GCMS를 사용하여 대사 산물과 탄화수소를 측정하고 RNA 염기서열분석 데이터 획득을 사용하여 전사체를 분석합니다. 궁극적으로, RNA 염기서열분석을 통한 대사 산물 프로파일링과 전사 프로파일링의 조합은 담배 나무 잎이 어떻게 장쇄 탄화수소 및 기타 중요한 화합물을 발생시키는지를 보여주는 데 사용됩니다. 이 방법은 담배 나무의 잎에서 만들어진 중요한 유용한 대사 산물을 식별하고 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.

이 방법은 담배 나무 대사체에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 담배 또는 관련 종과 같은 다른 시스템에도 사용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 담배 나무 잎에서 좋은 RNA를 추출하기 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

이 멀티 Bioo PRO 비디오에서는 FERNA 그룹의 구성원이 대사를 추출하고 프로파일링하는 것을 볼 수 있습니다. GCMS를 사용하면 Fraser Group의 구성원이 탄화수소를 추출하는 것을 볼 수 있으며, RNA 염기서열분석을 위해 RNA를 추출할 제 그룹의 구성원 한 명도 볼 수 있습니다.1차 대사 산물을 준비하기 위해 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 M 두 개의 전문 성장 배지가 포함된 30cm 직경의 화분에서 neko Oceana Glauca 식물을 재배하는 것으로 시작합니다. 식물의 잎과 줄기를 수확하고 재료를 즉시 동결 동결 3 일 동안 동결 건조하여 냉동 식물 재료를 동결 건조 한 다음 믹서 밀로 동결 건조 샘플을 금속 볼로 분쇄하고 생성 된 미세 분쇄 건조 물질을 2 밀리리터 원심 분리기 튜브 또는 유리 바이알로 분취합니다. 다음으로, 잎 10mg 또는 줄기 가루 20mg을 빻은 건조 식물 재료를 2ml의 나사 뚜껑, 둥근 바닥 튜브에 분취합니다.

1.4ml의 100% 메탄올을 넣고 10초 동안 와류를 일으킵니다. 그런 다음 와류를 일으키기 전에 60마이크로리터의 늑골 환초를 내부 정량 표준으로 추가합니다. 추가 10초 동안 스테인리스강 볼 1개를 추가하고 10분 동안 원심분리한 후 25Hz에서 2분 동안 믹서 밀로 재료를 균질화합니다.

11에, 000배 중력, 유리제 작은 유리병에 상등액을 옮기십시오. 750마이크로리터의 클로로포름과 1.5ml의 물을 넣고 10초 동안 혼합물을 볼텍싱합니다. 그런 다음 상부에서 150마이크로리터를 새로운 1.5ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 스피드 진공청소기를 사용하여 샘플을 건조시킵니다. 잔류 액체가 없을 때까지 3시간에서 24시간 동안 샘플을 건조시키는 것이 중요합니다. 건조되면 40 마이크로 리터의 메틸 하이드로 클로라이드를 첨가하십시오.

그런 다음 수평 열 블록 셰이커에 믹스를 넣고 섭씨 37도에서 2시간 동안 흔듭니다. 70마이크로리터의 M-S-T-F-A 믹스를 넣은 후 섭씨 37도에서 2시간 동안 다시 흔듭니다. GC MS 분석에 적합한 유리 바이알로 액체를 옮기기 전에 짧은 원심분리를 통해 덮개의 방울을 떨어뜨립니다.

다음 GCMS는 질량 분석 데이터 분석을 위한 소프트웨어를 구성하고 처리할 데이터 분석을 선택하여 데이터를 분석합니다. 화합물 등급에 따라 감지된 관심 피크의 표를 준비합니다. 표준 화합물의 연합을 통해 피크를 식별한 후, 탄화수소 추출을 위한 질량 분석 분석, 구조 특성화 알고리즘, 문헌 조사 및 대사 산물 데이터베이스 검색을 사용하여 검출된 피크에 주석을 달 수 있습니다.

갓 수확한 ncoa glauco 잎 약 200mg을 파산 상태로 2-20분 동안 담그고 잎을 제거하고 회전 증발로 용매를 완전히 건조시킵니다. 그런 다음 1ml의 HPLC 등급 헥산에 샘플을 재현탁합니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 매개변수를 사용하여 샘플에 대한 GCM s 분석을 계속 진행합니다.

초기에는 자동화된 MS를 사용하여 크로마토그램 성분을 처리합니다. 디콘볼루션 및 식별 시스템과 NIST 98 MS. 도서관. 머무름 시간과 고전적인 단편화 패턴을 알려진 실제 표준물질과 비교하여 포화 장쇄 아칸 탄화수소의 식별을 확인합니다. 다음으로, 적분 피크 면적을 용량 반응 곡선과 비교하여 탄화수소를 정량적으로 측정합니다.

확실한 표준으로 구성되어 Excel 소프트웨어를 사용하여 평균과 평균의 표준 오차를 계산합니다. 이 프로토콜은 TRIOL RNA 추출과 RN easy kit를 결합하여 믹서 밀의 금속 볼을 사용하여 2밀리리터 원심분리기 튜브에서 고품질 RNA 분쇄 100mg의 냉동 식물 재료를 얻습니다. 표본 균질화 다음, 12의, 000배 중력 및 4 섭씨 온도에 10 분 동안 물자를 원심분리한 후에 triol의 1 밀리리터를 추가하십시오.

상등액을 새 반응 튜브로 옮깁니다. 클로로포름 200마이크로리터를 넣고 튜브를 여러 번 뒤집은 후 실온에서 3분 동안 배양합니다. 혼합물을 15분 동안 원심분리한 후.

이전과 마찬가지로 상부 수성상을 새 반응 튜브로 옮깁니다. 약 2.5 부피의 에탄올을 첨가하십시오. 튜브를 여러 번 뒤집고 영하 80도에서 30분 동안 배양합니다.

다음으로, 침전물을 포함한 샘플을 스핀 컬럼으로 이동합니다. 8, 000배 중력에 15 초 동안 란을 원심분리기하고 처음부터 끝까지 교류를 버리십시오. 추출 키트에 제공된 700마이크로리터의 세척 버퍼 RW one을 스핀 컬럼과 원심분리기에 추가합니다.

다시, 플로우 스루를 버린 후 500마이크로리터의 두 번째 세척 버퍼, 키트에서 제공하는 RPE를 스핀 컬럼에 추가합니다. 컬럼을 다시 원심분리하고 버퍼 RPE를 추가하고 원심분리하기 전에 플로우 스루를 폐기합니다. 이전과 같이, 그 때 스핀 컬럼을 새로운 1.5 밀리리터 반응 튜브에 넣고 50 마이크로리터의 RNA 자유수 원심분리기를 추가하고, 8, 000 배 중력에서 1분 동안 컬럼을 용리하기 위해, RNA를 첨가한다.

제조업체의 지침에 따라 DNA가 없는 키트를 사용하여 잔여 DNA를 제거합니다. 마지막 단계로 RNA의 품질을 결정합니다. RNA는 차세대 염기서열분석을 위해 RNA를 보내기 전에 RNA 무결성 수치가 8 이상이어야 합니다.

HPLC 프로파일은 ncoa glauca 잎 추출물의 이소프레노이드 분석의 대표적인 결과를 보여줍니다. C 40 이상의 다양한 ISOPRENOID는 포토 다이오드 어레이 검출기를 사용하여 검출되었습니다. 피크는 코드 크로마토그래피와 실제 표준 간의 스펙트럼 비교를 기반으로 주석이 추가되었습니다.

두 개의 MS 크로마토그램은 ncoa, glauco 잎 및 줄기 물질의 1차 대사 산물 분석의 결과입니다. 세린에 해당하는 피크의 MS 스펙트럼도 주어지며, 예를 들어 RNA의 품질을 결정하는 데 사용되는 바이오 분석기의 대표적인 출력이 표시됩니다. 크로마토그램에서 두 개의 주요 피크는 18s 및 25s 리보솜에 해당하며, RNA는 이 샘플에서 온전한 RNA를 나타냅니다.

단편화된 리보솜 RNA의 추가 피크는 부분적으로 또는 심하게 분해된 RNA의 경우 나타납니다. 이 기술은 신속하게 수행 할 수 있으며 이 절차에 따라 다른 대사 산물의 분석과 호환됩니다. realtime PCR 또는 RNA를 분석하는 다른 방법과 같은 다른 방법을 사용하여 작은 RNA 생산 또는 특정 유전자 발현과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 담배 나무에서 대사 산물 데이터를 추출하고 평가하는 방법을 매우 잘 이해하게 될 것입니다.