神経高密度コア小胞の超解像イメージング

次の手順の全体的な目標は、蛍光顕微鏡では達成できない解像度で小胞組織の重要な側面を解明する超解像蛍光画像を取得することです。これは、最初に海馬ニューロンをDNAコードで横断し、小胞貨物の光変換キメラによって達成されます。第2ステップでは、まばらにサンプリングされた生画像を超解像顕微鏡システムで収集します。

次に、生の画像を処理して超解像画像を生成します。最後のステップでは、データを定量化して小胞の組織化を解明します。最終的に、涙点強度のラインプロファイルを使用して、小胞の分離を小胞の幅と比較することができ、それにより、この手順を使用して小胞がクラスターを生成するのに十分近いかどうかを決定することができる。

単色光活性化ローカリゼーション顕微鏡法または手のひらを使用して、ほとんどの種類の培養細胞のオルガネラの組織を研究することができます。画像取得用の超解像イメージングシステムを起動するには、まずアークランプの電源をONにします。次に、システムPCとコンポーネントのスイッチを電源リモコンに切り替えます。

顕微鏡制御タブレットがオンになったら、コンピューターの電源を入れてソフトウェアを起動します。ブートステータスウィンドウを展開して、システムが正常にロードされていることを確認し、ログインダイアログでシステムの起動オプションを選択します。サンプルを視覚化するために配置するには、レーザー安全キャビネットのフロントパネルとトップパネルを開き、透過光アームを傾けてステージと対物レンズにアクセスします。

次に、アルファプランAPO Chromat 100 x全反射、蛍光、または芝対物レンズに油を塗ります。次に、最初のフォーカスステップで低倍率の対物レンズを選択します。次に、サンプルをステージにマウントし、対物レンズをサンプルに向かって上げます。

コントロールタブレットのX、Y、Z機能を使用してレンズ位置を監視します。レンズがピントが合ったときに停止します。サンプルを視覚化し、フォーカスを微調整します。

ライトアームを下げ、アクセスパネルを完全に閉じます。次に、[検索]タブで、接眼拡大記号をクリックします 光路の概略図を表示するには、[trans on]を選択し、回路図に電球からの透過光がサンプルに衝突していることが示されていることを確認します。接眼レンズを覗き込み、コントロールタブレットをガイドとして使用して細胞に焦点を合わせます。

次に、DRA 2を発現する細胞を特定するために、デン2からの緑色発光を見るのに適した反射光とフィルターを選択します。低強度の反射光を使用して、健康な明るい細胞が見つかるまでカバースリップをスキャンし、手のひらデータを取得するようにソフトウェアを設定します。[取得]タブに切り替え、実験マネージャーを使用して適切な実験用手のひら取得設定を読み込みます。

ポップアップメニューにレーザーのスイッチオンに関するクエリが表示されたら、「はい」をクリックして、セルのイメージをカメラ平面にフォーカスします。488トラックのみを選択してください。E-M-C-C-Dゲインなどの集録パラメータを調整し、連続集録を選択します。

次に、ディスプレイを希望の明るさに調整し、画面上の画像にピントが合うまで対物レンズを動かします。次に、従来の広視野画像を収集するには、スナップボタンをクリックして画像を保存します。488トラックに芝ベースの照明を設定するには、エピターフボタンのターフを選択します。

芝ベースの照明を最適化するには、連続取得を選択し、背景が突然暗くなり、試料が1つの平面だけに集中できるようになるまで、芝の角度を明るく調整します。405ナノメートルレーザーをオフにして561トラックに切り替えます。E-M-C-C-D ゲインを約 200 に設定し、露光時間を約 50 ミリ秒に設定します。

赤で透過する発光フィルターを選択し、レーザー強度を約40%に設定し、561トラックの芝の角度を再確認してください。背景を減らすには、背景が薄くなるまでサンプルを照らします。561レーザーのみをアクティブにして561トラックを使用します。

手のひらデータを収集するには、561トラックの405ナノメートルレーザーをオンにし、405レーザーの強度を約0.01%に調整します取得中に計算された手のひら画像を監視するには、オンライン処理オプションメニューを展開し、デフォルトのパラメータで処理する手のひらのオンライン処理をオンにします。データ収集中に取得を開始するには、[実験の開始]をクリックして、写真変換を視覚的に監視し、405ナノメートルの写真変換レーザーの強度を高めます。義歯2枚の写真変換が減少し始めるとき。

レーザー強度の増加に伴って写真の変換が増加しなくなった場合は、[現在のステップを終了]をクリックします。実験を終了するには、ファイルを保存します。保存した画像を処理するには、[処理]タブをクリックし、メソッドメニューを展開して、[手のひら]サブメニューを展開します。

4つのサブオプションから手のひらを再度選択します。適切な画像を選択して、表示ウィンドウに表示します。メソッドパラメーターを展開して[選択]をクリックして画像を入力し、設定フィールドを展開して[デフォルト]を選択し、デフォルトオプションを使用してピーク検出とローカリゼーションを実行します。

[処理] タブで [適用] を押すと、手のひら画像が計算され、表示ウィンドウの別のタブに表示され、データ内のサンプリングが不十分なコンポーネントを除外します。ナイキストサンプリング定理とパーム外れ値の削除ツールを使用して、ピーク間の平均間隔、小文字のDが直径の小胞を解決するには大きすぎる領域のピークを削除し、表示ウィンドウに手のひら画像がある大文字のD、[選択]をクリックして画像を入力し、[適用]をクリックします。新しい画像は、表示ウィンドウの別のタブに表示され、ローカライズが不十分な植物相を除外します。四つんばい。

PALフィルタータブに移動し、受け入れられた植物相を閉じ込めます。35ナノメートル未満のシグマに対する4つのローカリゼーション精度。手のひら画像の表示モードを選択するには、[PALレンダリング]タブに移動し、ピクセル解像度と目的の表示モードを選択します。

この画像では、ニューロンの密集したコア小胞またはDCVのイメージングと処理の代表的な手のひらの最終生成物が赤で示されています。白でローカライズされた植物相の4の横座標は、Centro表示モードを使用して表示され、関連する小胞の超解像画像は、ガウス表示モードを使用して表示されます。この2番目の図では、tpaを発現する8日間のin vitro海馬ニューロンの体細胞と近位プロセスの画像で、緑色と赤色の手のひらの類似の広視野、危険性2が表示されています。

画像の重要な特徴には、広範な1対1の対応と、プンクタと従来の手のひら画像との間の黄色のオーバーラップが含まれます。ヤシの点の大幅に小さいサイズと、単一の広視野の点を複数の手のひらのプンタに時折解決します。ここでは、tpaを発現する第2の海馬ニューロンの1つのプロセスの一部に沿ったD cvsの手のひら画像。

DENDRAの2つが表示されています。puncta の直径が小さく均質な外観と、密接に対向した puncta のまれな観察は、推定上の DCV クラスターを表していることに注意してください。この最終的な図では、2つ以上のCVがクラスターを構成するのに十分近いかどうかを判断するための簡単な定量的方法が概説されています。

グラフに示すように、点状強度のラインプロファイルが生成され、DCV分離とDCV幅を定量化するために使用できます。分離が幅を大幅に超える場合、D cvsは互いに接触しません。分離が幅とほぼ同じである場合、これらの基準に基づいてCVSが接触している可能性がありますが、この画像のCVSは接触していないと分類されましたが、この手順に従って、この画像のCVSは接触していると分類されました。

2色の手のひらなどの他の方法を使用して、異なる構造の相対的な局在を研究できます。