高速3D-構造化照明顕微鏡（F3D-SIM）を使用したライブ細菌における細胞質分裂のZリングの超解像イメージング

この手順の総合的な目的は、細菌の細胞分裂中におけるタンパク質FTSZの動的な変化を観察することです。これは、FTSZ-GFP融合タンパク質を発現しているBacillus subtilis細胞を、小型のアガロースパッドの表面に塗布することで達成されます。その後、パッドを反転させ、ガラスカバーガラス底のペトリ皿に転写します。

第2のステップは、3D構造照明顕微鏡（3D SIM）イメージングシステムを用いて、細胞分裂中の細菌のタイムラプス画像を取得することです。次に、生データの品質を評価し、光退色により強度が30%以上低下した画像を除外します。最後のステップは、F-T-S-Z-G-F-Pタンパク質の蛍光強度分布の時間的変化を測定することにより、細胞分裂中のタンパク質局在の変化を定量的に分析することです。

最終的に、高速3D SIMを用いて、細菌の細胞分裂におけるdioneタンパク質のダイナミクスを明らかにします。共焦点顕微鏡などの既存の技術に対するこの手法の主な利点は、生細胞内の細胞分裂で起こる変化について、三次元的な情報を得られることです。この方法は細菌の細胞質分裂に関する知見を提供しますが、哺乳類細胞などの、動的なタンパク質の変化を観察したい他の系にも応用可能です。

私たちは、固定した細菌細胞の従来の3Dシミュレーション画像において、FDZタンパク質がZリング周囲に均一に分布していないことを確認し、最初にこのアイデアを得ました。私たちは、この分布がZリングの収縮中に起こる変化に関連しているかどうかをさらに詳しく調べたいと考えました。一般的に、この手法に不慣れな方は、オイルの屈折率をサンプルに合わせられないために苦労することが多く、それが画像の品質低下につながります。

イメージング用に bacillus subtlest 細胞を調製するには、テキストプロトコルに詳しく記載されている通り、細胞を対数増殖期中期まで培養します。次に、薄いポリエステルシートを取り除いてから、接着フレームを標準的なガラス製顕微鏡スライドに貼り付けます。その後、フレームの露出した接着面を顕微鏡スライドの表面に押し当て、スライド上に正方形のウェルを形成します。後続のステップでカバーガラスが張り付くのを防ぐため、厚いポリエステルシートはフレームに付けたままにしておきます。

次に、aro溶液を電子レンジで沸騰するまで加熱溶解し、溶解したaro 67 µLを接着フレームにピペットで分注します。直ちにaroの上にカバースリップを置いて表面を平らにし、室温で5〜10分間放置します。サンプルの回収を行う間、カバースリップを1〜2分間取り除きます。

8,000 RPMで遠心分離した後、サンプルの1 mL分注液を回収し、上清を除去してペレットを200 µLの新鮮な培地で再懸濁します。濃縮したサンプルの2.5 µLを分注し、あらかじめ準備したarosパッドの上に滴下します。サンプルをarosパッドの平らな表面に均一に広げます。

次に、ピンセットを用いて、arosパッドに触れないように顕微鏡スライドから接着フレームを取り除きます。顕微鏡スライドからarosパッドを、ガラスカバースリップ底の直径35 millimeterのペトリ皿に移します。

高解像度イメージングを行うため、arosパッドを反転させ、細胞懸濁液がペトリ皿のカバースリップに接触するようにします。実験当日は、システムとレーザーを完全に安定させるため、イメージングの少なくとも1時間前にOMX 3D SIMイメージングシステムを起動してください。

次に、マスターコントローラーワークステーションで、テキストプロトコルに記載されている各コンポーネントの電源を入れます。アイコンをクリックしてOMXソフトウェアを起動します。データ保存用のファイルパスを適切なデータフォルダに設定します。

次に、Softworkソフトウェアを起動します。メイン画面のライトパラメータセクションで、実験に必要なレーザーをオンにします。チャンネル選択からFITCカメラを有効にし、テキストプロトコルに記載されているパラメータを確認してください。

対物レンズの先端にオイルを1滴滴下します。準備した細胞が入ったサンプル用ペトリ皿をステージのインセットに設置し、円形の加熱用蓋で覆います。オイルがサンプル用ペトリ皿の底に触れるまでステージを下げます。

ディッシュをステージ上で15分間放置し、温度を平衡化させます。低露光設定を用いて、ナノポジショニングステージのコントロールでサンプルに焦点を合わせます。サンプルの焦点面の上方および下方に焦点を移動させ、光が均一に広がっているかを確認します。次に、0.5 micron刻みでステップ移動させ、画像スタックの上端と下端をマークします。その後、サンプルの中心に戻り、「Experiment」タブで「Get Thickness」ボタンをクリックして、サンプルの取得厚さを設定します。

現在の露光量および光透過率の設定におけるサンプル画像の最大強度値を決定します。この値は画像ウィンドウの下に表示されます。タイムラプス撮影の場合、最大強度が1100から1400になるように露光量と光透過率を調整してください。

背景レベル以上であること。画像については、エクスペリメントタブのタイムラプスセクションを有効にします。必要なフレームレートと、データファイル内の合計時間を設定してください。

適切なファイル名を入力します。実行ボタンをクリックして、画像取得を開始します。タイムシリーズの最初のフレームにおける、画像取得開始時の最大輝度値を記録してください。

最初のフレームの取得終了時に、この初回のフレームにおいてZackを通じた信号強度の低下が10%を超えていないことを確認します。時系列データの取得終了後、接尾辞にDVが付いた結果のRAW画像ファイルを開き、時系列の開始時から最終画像までの最大信号強度の低下を確認します。30%以上の光退色が生じているタイムポイントは、プロセスメニューから破棄し、SI再構成ウィンドウを起動します。

すべてのパラメータに既存の設定を使用します。使用するチャネル固有のOTFボタンを有効にし、標準フィルターセットに設定します。使用するチャネル固有のKO anglesボタンを有効にし、標準フィルターセットに設定します。

RAWファイルを入力ファイルスペースにドラッグ・アンド・ドロップします。「do it」をクリックしてください。Zリング周囲のFTSZの分布を調べ、3D強度プロットを作成します。

次に、3D画像ファイルを開きます。個々のzスライスを表示するには、表示メニュータブにあるボリュームビューアーツールを使用します。

関心領域をクロップするには、この3D画像のウィンドウ番号を入力ウィンドウに入力し、新しく未使用のウィンドウ番号を出力ウィンドウに入力してください。「領域選択」ボタンが有効になり、元の40 by 40 micronの視野から特定の関心のあるZリングをクロップできるようになります。回転タブで、希望する軸と回転角度を調整してください。

「do it」ボタンをクリックします。ボリューム内をスクロールして、目的の視点であるZリングを表示させます。データインスペクターツールを使用して列・行の寸法を調整し、個々のZリングを中心とした新しい関心領域（ROI）を作成します。

画像の中央をクリックして、この新しい関心領域（ROI）を配置します。テキスト画像データは、関心領域内の各ピクセルの蛍光強度を表示する自動生成テーブルです。3Dグラフボタンをクリックして、まず強度プロットを表示してください。

あるいは、「save table data」ボタンをクリックしてテキスト形式の画像データをエクスポートすることもできます。ファイルメニューから、保存されたテキストファイル内の画像データを新しいスプレッドシートにコピーします。スプレッドシート内のすべてのセルを選択し、新しい3D曲面グラフを作成します。

タイムラプスデータの3D強度プロットグラフを、出版用にフォーマットします。3D画像ファイルの各タイムポイントについて、これらの手順を繰り返します。従来の広視野蛍光顕微鏡で可視化すると、bacillus subtlesにおいてZリングは単一の横方向の蛍光バンドとして現れます。

このバンド全体の蛍光強度は均一です。この局在パターンからは、ここにあるリング内でのFTSポリマーの構造的組織化や分布に関する知見はほとんど得られません。ここでは同じ細胞を FAST 3D sim 法を用いて観察しています。

3D sim画像のZ軸を中心とした回転により、Zリングを三次元空間における真のリング構造として可視化することが可能になります。解像度の向上により、リング内におけるFTSZの不均一な分布を可視化できるようになりました。この手法で可視化したBacillusのZリングの追加例からは、Zリング周囲の蛍光強度が決して一定ではないことが示されています。

さらに、蛍光強度が非常に低い領域やギャップが観察されます。これらの観察結果を定量化するために、Zリングの3D強度プロットを作成しました。この強度プロットにより、bacillus subtlestのZリングの異なる領域間で、蛍光量に最大4倍の変動があることが示されました。

3D強度プロットにより、Zリング内で起こる動的な変化を解析するために、ギャップ部分がほぼ背景蛍光のベースラインレベルである的に読み取れることが示されています。時間の経過とともに、3Dシミュレーションのタイムラプスが実行されます。この動画では、bacillus subtleのZリング内のFTSZが絶えず変化している様子が示されており、各画像に対して生成された強度プロットで測定されています。

このビデオを視聴することで、細菌細胞の培養と調製方法、3D Simを用いたイメージング方法、定量データを取得するための解析方法、そして最終的にプレゼンテーション品質の画像を作成する方法について十分に理解することができます。画像取得の間、細胞の状態を監視すること、また、取得中の蛍光タンパク質の発現レベルを監視することが非常に重要です。この技術の開発により、細菌細胞生物学分野の他の研究者が他の超解像顕微鏡法を利用し、異なる生物における他の細菌タンパク質を局在化させることが可能になりました。

この手順に続いて、光活性化局在化顕微鏡法などの他の超解像顕微鏡法を用いることで、FDSタンパク質の経時的な動的変化を観察することが可能です。