Name: Transecção medular nos larval Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-21T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Aprenda a realizar transecção medular em larvas de zebrafish usando pipeta de microinjeção biselada. Este método reprodutível permite estudar regeneração neural com recuperação sensorial em 2 dias e funcional em 6 semanas.

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Somos gratos à facilidade zebrafish Universidade de Utah para criação de animais. RID foi financiado pelo NIH R56NS053897 e LKB era um estagiário predoctoral apoiado pela iniciativa HHMI Med-Into-Grad.

Peixe-zebra foram levantadas e produzido de acordo com processos padrão; experiências foram aprovadas pelo Comité de University Animal Care and Use Institucional Utah. 1. Preparação de Placas Cirurgia <ol><li> Faça placas de cirurgia usando 60 milímetros placas de Petri e Sylgard 184 Elastômero de Silicone Kit, seguindo as instruções do fabricante. Preencha pratos não mais do que meio cheio e permitir a polimerizar. Tapados à temperatura ambiente. </li></ol> 2. Preparação de Micropipetas <ol><li> Fabricar micropipetas aquecendo e puxando de parede fina tubo de borosilicato capilar em um extrator micropipeta usando as mesmas configurações para fazer agulhas microinjeção. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, snap off ponta de micropipeta para cerca de 200 m de diâmetro com pinça. </li><li> Bisel borda quebrada com um microgrinder inicialmente a 35 °, seguida por uma segunda chanfradura a 25 °. Certifique-se de ponta é afiada e smooth. Loja terminou micropipeta chanfrado em uma placa de Petri com uma pequena quantidade de argila. </li></ol> 3. Preparação de Zebrafish Larvas <ol><li> 7 dias antes da cirurgia, montar tanques de acasalamento dos peixes-zebra macho e fêmea. </li><li> Coletar embriões na manhã seguinte, 3 horas após as luzes se acendem para garantir um rendimento máximo. Se estiver usando uma linha repórter transgênico como Tg (elevl3: eGFP) knu3, os embriões fertilizados tipo 100/100 mm Placa em 25 ml de E3 em 28,5 ° C. Se estiver usando o tipo selvagem, espécie fertilizado embriões placa 25/100 mm de 25 ml de E3 em 28,5 ° C. </li><li> Se estiver usando uma linha de repórter, tela embriões para expressão fluorescente em 48 hpf. Permitir embriões identificados para amadurecer a uma densidade de placa 25/100 mm de 25 ml de E3 a 28,5 ° C. </li><li> Quando as larvas são de 5 dpf, preparar placa cirurgia cobrindo Sylgard com E2 + 10 mg / L de Gentamicina Sulfato (GS) + tricaina. <ol><li> Prepare recuperação prato, adicionando 25 ml E2 + GS para um 100 milímetros dis Petrih. </li><li> Prepare bisturi gravando juntos três swabs. Isto vai formar uma ferramenta triangular com três ranhuras. </li><li> Montar uma micropipeta preparado sobre os cotonetes gravando-o em uma das ranhuras. </li></ol></li><li> Se reutilização de micropipetas, lave até claro com E2 + GS usando uma seringa de 1 ml e uma agulha de 27 G antes da montagem em swabs. </li></ol> 4. Cirurgia <ol><li> Anestesiar um prato de larvas de cada vez (25 peixes) com tricaina. Os peixes são suficientemente anestesiados quando eles já não apresentam resposta ao toque. É importante que os peixes são completamente anestesiado antes da cirurgia, caso contrário, eles vão se contrair quando o bisturi toca-los. A cirurgia é realizada sob um microscópio de dissecção. </li><li> Transferência das larvas para placa de cirurgia. <ol><li> Sob ampliação máxima, gire uma larva de cada vez para que ele fique de lado com as costas mais próximo da mão segurando o bisturi. </li><li> Posição pinça de modo que eles estejam sobre o Sylgard,angular ao longo da largura da larva. </li><li> Apoiando o bisturi de vidro contra um dos braços da pinça, corte na face dorsal lateral da lagarta no nível do poro anal, tendo a certeza de não corte para além da borda ventral da notocorda. Torça o bisturi para cortar a medula espinhal. </li><li> Repita com larvas restante. Nota: se uma larva sangra, ele não vai se recuperar da cirurgia. Remover imediatamente a larva da placa cirurgia e sacrificá-lo via tricaina overdose. </li></ol></li><li> Uma vez que a cirurgia no lote de larvas está completa, a transferência de animais feridos para a placa de recuperação. Este é apoiar a compensação da anestesia. <ol><li> Atenção: ao coletar larvas ferido para a transferência, certifique-se que sejam coletadas cabeça ou cauda em primeiro lugar: não se estresse do local da lesão, dobrando as larvas. Nota: Todos os dispositivos utilizados para a cirurgia pode ser reutilizado, incluindo as micropipetas. </li></ol></li></ol> 5. Recuperação <ol><li> Transfer ferido larvas a partir da placa de recuperação para placas de 100 mm cheias com 25 ml de E2 + GS, a uma densidade de 25/plate. Permitir a se recuperar em uma incubadora de 28,5 ° C. </li><li> Verifique placas diariamente, removendo animais doentes e mortas. Não altere a mídia até Coleps (protozoários de água doce) são visíveis na mídia. Ao trocar a mídia, não transferir o peixe para uma nova placa; em vez disso, remova o máximo de mídia como possível e inundar a mesma placa com as novas mídias. Repita conforme necessário para reduzir a população Coleps. </li><li> Alimente diariamente com uma pequena quantidade de alimento frito em pó. Nota: Alimento vivo (por exemplo, paramecia ou rotíferos) não podem ser alimentados com larvas ferido até depois de terem recuperado a locomoção. Caso contrário, o alimento vivo vai colonizar o local da lesão e matar as larvas. </li></ol>

<ol><li>Houweling, D. A., Bär, P. R., Gispen, W. H., Joosten, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury%3A+bridging+the+lesion+and+the+role+of+neurotrophic+factors+in+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+brain+research%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury: bridging the lesion and the role of neurotrophic factors in repair.</a> Progress in brain research. 117, 455-471 (1998).</li>
<li>Mikami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+dendritic+cells+in+injured+adult+spinal+cord+results+in+activation+of+endogenous+neural+stem%2Fprogenitor+cells+leading+to+de+novo+neurogenesis+and+functional+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Implantation of dendritic cells in injured adult spinal cord results in activation of endogenous neural stem/progenitor cells leading to de novo neurogenesis and functional recovery.</a> Journal of neuroscience research. 76 (4), 453-465 (2004).</li>
<li>Chernoff, E. A. G., Sato, K., Corn, A., Karcavich, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+regeneration%3A+intrinsic+properties+and+emerging+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Spinal cord regeneration: intrinsic properties and emerging mechanisms.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 361-368 (2002).</li>
<li>Kuscha, V., Barreiro-Iglesias, A., Becker, C. G., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+tyrosine+hydroxylase+and+serotonergic+systems+in+the+regenerating+spinal+cord+of+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of tyrosine hydroxylase and serotonergic systems in the regenerating spinal cord of adult zebrafish.</a> The Journal of comparative neurology. 520 (5), 933-951 (2012).</li>
<li>Becker, C. G., Lieberoth, B. C., Morellini, F., Feldner, J., Becker, T., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1.1+is+involved+in+spinal+cord+regeneration+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">L1.1 is involved in spinal cord regeneration in adult zebrafish.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (36), 7837-7842 (2004).</li>
<li>Hui, S. P., Dutta, A., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+response+after+crush+injury+in+adult+zebrafish+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Cellular response after crush injury in adult zebrafish spinal cord.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 239 (11), 2962-2979 (2010).</li>
<li>Goldshmit, Y., Sztal, T. E., Jusuf, P. R., Hall, T. E., Nguyen-Chi, M., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf-dependent+glial+cell+bridges+facilitate+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fgf-dependent glial cell bridges facilitate spinal cord regeneration in zebrafish.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7477-7492 (2012).</li>
<li>Reimer, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+regeneration+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Motor neuron regeneration in adult zebrafish.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).</li>
<li>Hale, M. E., Ritter, D. A., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+confocal+study+of+spinal+interneurons+in+living+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">A confocal study of spinal interneurons in living larval zebrafish.</a> The Journal of comparative neurology. 437 (1), 1-16 (2001).</li>
<li>Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP-induced+repair+of+zebrafish+spinal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits.</a> Science. 305 (5681), 254-258 (2004).</li>
<li>McClenahan, P., Troup, M., Scott, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fin-tail+coordination+during+escape+and+predatory+behavior+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Fin-tail coordination during escape and predatory behavior in larval zebrafish.</a> PloS one. 7 (2), (2012).</li>
<li>Kim, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repressor+activity+of+Headless%2FTcf3+is+essential+for+vertebrate+head+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Repressor activity of Headless/Tcf3 is essential for vertebrate head formation.</a> Nature. 407 (6806), 913-916 (2000).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Quando inicialmente aprender esta técnica, recomendamos tentar não mais de 50-100 transecções em uma única sessão. Depois de dominar essa técnica, somos capazes de transecto até 300 embriões por hora; no entanto, este nível de rendimento requer alguns meses de prática semanal. Recomenda-se também a prática com uma linha de repórter e verificando transsecção completa até a incidência de incompleto transecção da medula espinal é reduzida para menos de 1%. Transecção da medula espinhal no peixe...

Grande trauma da medula espinal humana, muitas vezes resulta em paralisia permanente e perda de sensibilidade abaixo do nível da lesão, devido à incapacidade de crescerem axónios ou reiniciar neurogénese 1,2. Em contraste com os mamíferos, no entanto, anamniotes incluindo salamandras e peixes-zebra (Danio rerio) mostram recuperação robusta, mesmo depois de medula espinhal completa transecção 3,4. O peixe-zebra adulto é um modelo bem estabelecido para estudar o processo de recuperação após lesão medular 5-7. Na sequência completa transecção da medula espinal, restabelecimento da função sensorial e locomotiva é observado no peixe-zebra adultos de 6 semanas após a lesão 8. A fim de examinar o processo regenerativo in vivo, nós nos voltamos para o peixe-zebra larval transparente 9. Aqui apresentamos um método para transecto da medula espinhal de um 5 dias após a fertilização (dpf) larval usi zebrafishng de uma pipeta de microinjecção chanfrada como um bisturi, modificado a partir de Bhatt, et ai. 10 Este método oferece suporte de alto rendimento, baixa mortalidade, e reprodutibilidade. Com a prática, 300 larvas / hr pode ser seccionado, e mais de 6 meses de transecções, incluindo mais de 3.600 animais, 98,75% ± 0,72% sobreviveram até sete dias pós-lesão (dpi). Nossos dados mostram uma recuperação rápida de locomoção e sensorial, bem como: a 1 dpi, todos os movimentos pelos peixes feridos é impulsionado por peitoral apenas locomoção fin. No entanto, as larvas começam a responder ao tungstênio agulha toque caudal à transecção por 2 dpi, restabelecer o movimento C-curva por 3 dpi, e exibir natação predatória por 5 dpi 11. Usando coloração de anticorpos contra tubulina acetilada, que confirmaram que os axônios estão ausentes do local da lesão a um dpi, mas cruzaram o local da lesão por 5 dpi. Acreditamos que este protocolo irá proporcionar uma técnica valiosa para o estudo da rebrota axonal e neurogênese na medula espinhal após lesão. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>Placa de Petri de 60 mm</td><td>VWR</td><td>82050-544</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 100 mm</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td></td></tr><tr><td>PDMS, Kit de elastômero de silicone Sylgard 184</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9644388</td><td></td></tr><tr><td>tubo capilar de borossilicato: OD 1,00 mm, ID 0,78 mm</td><td>Warner Instruments Inc.</td><td>64-0778</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Fine Scientific Tools Inc.</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>microscópio de dissecação</td><td>Nikon</td><td>SMZ6454</td><td></td></tr><tr><td>Microgrinder</td><td>Narishige</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Gentamicina</td><td>Amresco Inc.</td><td>0304-5G</td><td>dissolver em água 10 mg/ml, armazenar a -20 &graus; C</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Acros Organics</td><td>118000100</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador com ponta de algodão, madeira, 6 polegadas</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 ml</td><td>BD</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>27 G agulha</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Fry food</td><td>Argent Labs</td><td>F-ARGE-PTL-CN</td><td>loja em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Extrator de micropipetas</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Filamento de Caixa Modelo P-97</td><td>FB330B</td></tr><tr><td colspan="4">20x E2 (1 L); loja em RT</td></tr><tr><td>17,5 g NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-500</td><td></td></tr><tr><td>0,75 g KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>2,90 g CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Sigma</td><td>C7902-500G</td><td></td></tr><tr><td>4.90 g MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Merck</td><td>MX0070-1</td><td></td></tr><tr><td>0,41 g KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>0,12 g Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">500x NaCO3 (10 ml); </forte> fazer fresco, descartar</td></tr><tr><td>0,35 g extra NaCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">1x E2 (1 L); </forte> armazenar a RT</td></tr><tr><td>50 ml 20x E2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml fresco 500x NaCO3</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transecção medular nos larval zebrafish

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mamíferos falhar na recuperação sensorial e motora após lesão medular, devido à falta de rebrota axonal abaixo do nível da lesão, bem como a incapacidade de reiniciar a neurogênese espinhal. No entanto, alguns anamniotes incluindo o peixe-zebra Danio rerio exposição tanto sensorial e recuperação funcional, mesmo após transecção completa da medula espinhal. O peixe-zebra adulto é um organismo modelo estabelecido para o estudo da regeneração após lesão medular, com recuperação motora e sensorial por seis semanas após a lesão. Para aproveitar in vivo análise do processo regenerativo disponível no zebrafish larval transparente, bem como ferramentas genéticas não acessível no adulto, usamos o peixe-zebra larval para estudar a regeneração após transecção medular espinhal. Aqui demonstramos um método para reprodutível e verificável seccionar a medula espinhal larval. Após transecção, nossos dados mostram recuperação sensorial início em 2 dias após a lesão (dpi), sagacidadeh o movimento C-bend detectável por 3 dpi e retomada da natação livre por 5 dpi. Assim, propõe-se o peixe-zebra larval como uma ferramenta complementar para o peixe-zebra adulto para o estudo de recuperação após a lesão medular.

Para reduzir a severidade dos danos no tecido em torno do local da lesão, chanfradura adequada da micropipeta é crítica. Figura 1A mostra uma ponta chanfrada correctamente. Usando uma dica que é muito grande (Figura 1B) tende a resultar em fatalidades mais elevados devido ao aumento da probabilidade de entalhar a aorta dorsal, enquanto uma dica que é muito estreito (Figura 1C) tende a olhar para fora da pele ao invés de tecido de corte. Para...

Após transecção espinhal, adulto zebrafish tem recuperação funcional por seis semanas após a lesão. Para tirar proveito da transparência larval e recuperação mais rápida, apresentamos um método para seccionar a medula espinhal larval. Após transecção, observamos recuperação sensorial começando em 2 dias após a lesão, e movimento C-curva por 3 dias após a lesão.

Transecção medular nos larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

O objetivo geral deste procedimento é garantir a secção completa da medula espinhal em peixes-zebra larvais por meio de um método relativamente de alto rendimento e reprodutível, ao mesmo tempo que se maximiza a sobrevivência. Isso é conseguido primeiramente acasalando adultos do genótipo apropriado e realizando triagens conforme necessário. O segundo passo é criar os embriões até cinco dias após a fertilização.Em seguida, realize a secção com uma pipeta de microinjeção biselada. Por fim, os peixes lesionados têm permissão para se recuperar em meio tratado com antibiótico até o final do experimento. Em última instância, a microscopia de imunofluorescência é utilizada para demonstrar a resposta dos progenitores neurais à lesão.As principais vantagens desta técnica em comparação com métodos existentes, como os desenvolvidos pelos laboratórios Becker e fetcher, incluem um maior número de animais para estudo, um tempo de recuperação mais curto e o uso de ferramentas genéticas não disponíveis de outra forma no peixe-zebra adulto. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de regeneração, como a resposta dos progenitores neurais à lesão. Inicie os preparativos produzindo

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Neurociência

O método aqui apresentado compreende a lesão precisa de embriões vivos zebrafish com pulsos de laser de alta potência e a subsequente análise das lesões e sua recuperação com o tempo. Também mostramos como geneticamente marcado individual ou grupos de células do músculo esquelético pode ser monitorado durante e após o laser danos leves induzido.

Laser-infligido Lesão de Zebrafish muscular esquelético embrionário

Processos de desenvolvimento, tais como a proliferação, a modelagem, diferenciação, e a orientação do axónio pode ser facilmente modelada na medula espinal do peixe-zebra. Neste artigo, nós descrevemos um procedimento de montagem para os embriões de peixe-zebra, que otimiza a visualização destes eventos.

Dissecção e montagem lateral de embriões Zebrafish: Análise de Desenvolvimento da Medula Espinhal

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Spinal Cord Injury completo e Cérebro Dissection Protocolo para Wholemount Subsequente<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização em larval da lampreia de mar

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Stab ferida ferimento do peixe-zebra adulto Telencéfalo: Um método para investigar Vertebrados Cérebro Neurogênese e Regeneração

Este manuscrito descreve métodos para registos electrofisiolicos de neurónios espinais de embriões de peixe-zebra e larvas. A preparação mantém neurónios in situ e muitas vezes envolve a dissecção mínima. Estes métodos permitem o estudo electrofisiológico de uma variedade de neurónios espinais, a partir da aquisição inicial excitabilidade eléctrica através dos primeiros estádios larvares.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparação para gravações eletrofisiológicas da Spinal Sensorial e Motor Neurons

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Capaz de recuperação funcional após lesão medular, o zebrafish adulto é um sistema modelo de elucidar mecanismos inatas de regeneração neural. Aqui, descrevemos a resistência à natação e os ensaios de comportamento de natação como leituras funcionais da regeneração da medula espinhal.

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O presente protocolo descreve um método para induzir lesões específicas de tecido e altamente reprodutíveis em larvas de zebrafish usando um sistema de lesão a laser combinado com uma plataforma microfluida automatizada para o manuseio de larvas.

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A transeção da medula espinhal xenopus laevis é um método de lesão relevante para estudar lesão medular e regeneração, fazendo um corte transversal que corta completamente a medula espinhal no nível torácico.

Transeção da Medula Espinhal em Xenopus laevis Tadpoles

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Aqui apresentamos um protocolo para transplantar células com alta resolução espacial e temporal em embriões e larvas de peixe-zebra em qualquer estágio entre pelo menos 1 e 7 dias após a fertilização.

Transplante de células de alta resolução em peixe-zebra embrionário e larval

Aprenda a realizar transecção medular em larvas de zebrafish usando pipeta de microinjeção biselada. Este método reprodutível permite estudar regeneração neural com recuperação sensorial em 2 dias e funcional em 6 semanas.

Transecção medular nos larval Zebrafish

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