Aip1p Dinámica se alteran por la R256H Mutación de actina

El objetivo general de este procedimiento es visualizar el movimiento de la proteína de unión a la actina en la levadura que expresa una isoforma de actina mutante. Esto se logra fabricando primero un plásmido y recubriendo la proteína que interactúa con actina uno o un gen P IP uno marcado con una proteína fluorescente verde Fluor 4 de tres x. El segundo paso es generar una cepa de levadura que exprese solo el tipo salvaje o el acton mutante.

A continuación, el plásmido A IP one P marcado con GFP se transforma en la cepa de levadura de tipo salvaje o mutante. El paso final es obtener imágenes y analizar el movimiento de las células de levadura marcadas A, IP, una P en las células de levadura mutantes y de tipo salvaje. En definitiva, una reflexión interna total.

La fluorescencia o microscopía de césped se utiliza para mostrar que el A IP uno P se mueve más lentamente en la levadura que expresa el actón mutante R 2 56 H que el actón de tipo salvaje. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del citoesqueleto, como los movimientos temporales relativos de los socios de unión. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando descubrí que, a diferencia de la cepa de tipo salvaje, la eliminación de A IP y P de la cepa de levadura mutante era letal.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la microscopía confocal, es el contraste mejorado y la velocidad de imagen. En general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades para optimizar la configuración del microscopio para su experimento individual debido a los numerosos ajustes que se pueden realizar y la naturaleza subjetiva de la calidad de la imagen. Comience este protocolo con la generación del plásmido A IP one PGFP y la cepa de levadura mutante como se indica en el protocolo de texto, digiera el plásmido con una enzima de restricción para permitir la integración en el cultivo de cromosomas de levadura.

Las células S-C-V-C-A preparadas que no pueden sintetizar uracilo durante la noche en cinco mililitros de medios YPD en una rueda a 30 grados Celsius. Girar un mililitro de las células durante cinco minutos a 1000 veces g. A continuación, prepare la mezcla en placa como se indica en el protocolo de texto y filtre, esterilice el sobrenadante de las células y vuelva a suspender las células en el líquido restante a las células suspendidas.

Añadir dos microlitros de 10 miligramos por mililitro de ADN portador de testículos de salmón. A continuación, añada 10 microlitros del plásmido digerido, el ADN y el vórtice antes de añadir 0,5 mililitros de placa y volver a vórtice. Por último, añade 20 microlitros de un molar DI tres etol y vórtice.

Después de incubar la mezcla durante seis a ocho horas a 25 grados centígrados. Calentar las células en un baño de agua a 42 grados centígrados durante 10 minutos. Coloque 100 microlitros de las células desde la parte inferior del tubo de microcentrífuga donde se han asentado en una placa menos U.

Incubar a 30 grados centígrados durante dos o tres días o hasta que se formen colonias. Selecciona colonias individuales y sal a un punto negativo. ATO. Para prepararse para la microscopía, estas células contienen el plásmido con la A IP one GFP y UroGen integrados en el cromosoma.

Cultive un cultivo de las células de levadura con el PGFP A IP one incorporado en YPD durante la noche en una rueda a 30 grados Celsius de subcultivo. Un mililitro de la cultura de la noche a la mañana en nueve mililitros de medios menos euro. Haga crecer las células durante tres o cuatro horas adicionales en un agitador a 30 grados centígrados para asegurarse de que estén en la fase de crecimiento logarítmico.

A continuación, agregue tres microlitros de células a un portaobjetos de microscopio de vidrio y agregue un cubreobjetos. Deje que las células se asienten en el portaobjetos durante cinco minutos. Antes de colocar el portaobjetos en el soporte de la placa de la plataforma, observe la proteína A IP one PGFP con un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total o de césped utilizando un objetivo de césped de inmersión en aceite de 100 x y una cámara CCD digital.

Para centrarse en las celdas, abra el software Slide Book 5.0 y haga clic en el botón de la ventana de enfoque de la barra de herramientas. Para acceder a los controles de enfoque, seleccione la pestaña de alcance y seleccione el objetivo de césped 100 x. Encienda la lámpara y deslice la barra de la lámpara al 15%Cambie la configuración del contenedor a dos por dos y cambie el filtro a campo claro en el microscopio.

Utilice el estilo de enfoque fino para enfocar las celdas tal y como se ven en la pantalla del ordenador. Usando los controles dentro de la ventana de enfoque, apague la lámpara, cambie el filtro a vivo y haga clic en el botón T-I-R-F-M en el iluminador T-I-R-F-M conectado al puerto del lado derecho del microscopio. Encienda la emisión láser, seleccione la pestaña de transmisión dentro de la ventana de enfoque.

Marque la casilla junto a iniciar grabación y, a continuación, haga clic en el botón de campo claro del iluminador TIR FM. Gire el micrómetro para ajustar el ángulo de incidencia del láser. Esto se utiliza para optimizar la emisión fluorescente de los focos A IP one GFP y minimizar la fluorescencia de fondo de la gripe de las células y el deslizamiento cuando se muestra la imagen deseada.

Presione inicio. Obtenga imágenes durante 20 segundos a una velocidad de cinco fotogramas por segundo. Después de 20 segundos, presione detener.

Guarde las imágenes en la pestaña de archivo de la barra de menú principal. Seleccione Guardar diapositiva como e introduzca el archivo, la ubicación y el nombre. A continuación, utilice el software Image J.

Para analizar las imágenes, use el rastreador manual del complemento de macros para rastrear el movimiento y la velocidad de los focos fluorescentes A IP one P. Cambie el parámetro de intervalo de tiempo a 0,2 segundos. Con la selección de agregar pista, seleccione y rastree una proteína fluorescente individual a través de cuatro a ocho fotogramas conectivos.

Utilice el comando N track y la velocidad del movimiento de las proteínas entre cada fotograma se mostrará en una ventana de resultados. Determine la velocidad media entre cada fotograma. Usando una hoja de cálculo de Microsoft Excel.

Utilice los valores para calcular la velocidad media de un movimiento IP un P, o cada cepa de celda de interés para cuantificar un movimiento A IP one P. Se rastrearon más de 50 focos fluorescentes A IP y P en más de 10 células. Los resultados representativos de un movimiento IP one P en células de tipo salvaje se muestran como se esperaba.

El P marcado con fluorescencia a IP one se mueve rápidamente a través de la célula y luego desaparece en las células que expresan el mutante R 2 56 H Acton. Un IP one P tiene menos movimiento en comparación con las células de tipo salvaje. Se realiza un seguimiento de una IP una P utilizando la imagen J para mapear cuantitativamente el movimiento de la proteína.

Un IP uno P se extiende a través de la célula en la cepa de tipo salvaje, pero se mueve solo en una región restringida. En la cepa de actón mutante, se calculó la velocidad media para cada área fluorescente A IP una P. En las células de tipo salvaje, la velocidad media del movimiento de un IP un P es de 1,60 más o menos 0,42 micras por segundo, las células que expresan la actina mutante R 2 56 H que se sabe que tiene una morfología anormal del citoesqueleto de actina tienen un fenotipo A IP one P alterado en la cepa mutante.

Un movimiento de IP one P es restringido y más lento. La velocidad media del movimiento A IP one P es de 0,88, más o menos 0,30 micras por segundo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener imágenes de las proteínas del citoesqueleto mediante microscopía de césped.

Al usar este procedimiento, es importante recordar que no debe dejar que las células se sequen o se fotoblanqueen.