Name: 3次元細胞培養モデルの質量分析イメージング用試料調製の戦略 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 学ぶ 3次元細胞培養の質量分析イメージング試料調製法。ゼラチン包埋、クリオスタット切片、MALDI MSIによるタンパク質・脂質・代謝物の無標記検出を含む。がん生物学研究に有用です。

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この研究は、ノートルダム大学(DARW)のハーパーがん研究所への基礎がん研究の推進プログラムと、ピッツバーグ分析化学者協会(ABH)からの2011年のスターターグラントの下で、ワルサーがん財団によって支援されました。また、貴重な議論をしてくれた質量分析・プロテオミクスファシリティのスタッフにも感謝します。

イメージング用1. 3D細胞培養と準備<ol><li>培養に適切な細胞株、 すなわち、HCT116結腸癌細胞株、二次元、単層培養した。 </li><li>一般的には数日かかる50〜70％の集密度まで、5％CO 2インキュベーターでマッコイの5A培地+ 10％ウシ胎児血清を含むT-25フラスコにHCT 116細胞を増殖させる。 </li><li> 0.25％トリプシン-EDTA溶液で細胞を放出し、細胞密度および生存率をチェックするために、血球計数器およびトリパンブルー染色を用いて細胞の一部をカウントする。 </li><li>カウントした後、適当なウェル6000細胞/播種密度は、30,000細胞/ mlを達成するために完全培地で細胞を希釈する。 </li></ol> 2.アガロース被覆96ウェルプレートを準備します<ol><li> 50ミリリットルコニカルチューブ内の標準のメディアの10ミリリットル（メディアでの1.5％アガロース溶液）10にアガロースの0.19グラムを追加します。穏やかに混合することによって取り込みを確認してください。水浴中でアガロースオートクレーブ20分間。 </li><li>アガロース+媒体混合物の50μlをフラット60中央ウェル中に吸引する、マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルプレート培養プレート底。プレートの周縁部におけるウェルはわずかに高い蒸発速度を有するように、200μlの1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の代わりに、これらのエッジにアガロースを加える。 </li><li>アガロース混合物は、内側のウェルに添加された後に冷却するために脇にプレートをセット〜37 細胞の添加の前にCを°。 </li></ol>三次元培養を3シードとなりがち注：複数またはより少ない細胞が関与培養の要件に応じて播種することができるが、それはこれらの条件は、培養の10〜14日後に直径約1mmの三次元細胞培養構造をもたらすことが判明した（データは示していない） 。 <ol><li>アガロース被覆に（〜6000細胞を含むように希釈された）適切な細胞溶液200μlを追加します。96ウェルプレート。プレートをカバーし、細胞増殖のために37℃、5％CO 2の加湿インキュベーター内で設定。 </li><li>細胞媒体ごとに48時間の最小値を変更するか、またはメディアが表示されたときに色を変更すること。 <ol><li>慎重にアガロースの下にある（2日目までに肉眼で見える）小三次元細胞培養の周囲から古いメディアを吸引することによって、メディアを変更します。三次元細胞培養の上に静かに新鮮な培地200μlを追加します。 </li><li>これらのメディアの変更時には（オプションステップ）は、テストのための化学療法剤または他の薬剤を追加します。完全なメディアとの最終濃度になるように選択薬を希釈し、各ウェルに必要な200μlを添加する。 </li><li>三次元細胞培養物は、直径約1mmになるまで、光学顕微鏡で3次元細胞培養増殖をモニターする。 </li></ol></li></ol> 4.収穫の3D細胞培養<ol><li>優しくアガロースベッドから3D細胞培養を削除するには2ミリリットルの血清学的ピペットを使用してください。 </li> &lt;李は&gt;優しく待っている24ウェルプレートに約1mlのPBSにそれらをピペッティングすることによりPBSで3次元細胞培養物を洗ってください。 </li><li>転送は、タンパク質または代謝産物を抽出するための遠心管に、血清学的ピペットを介して三次元細胞培養物を収穫し、または画像化用途のためにスライスを支援するために、切断媒体に埋め込む。 </li></ol>ゼラチン5.埋め込みの3D細胞培養<ol><li>高純度の水で〜175 mg / mlのゼラチンの溶液を準備（18MΩ推奨）。22,23、激しくゼラチンを混ぜる。粘性および操作が困難になって解決策を守ってください。溶液が透明と吸引することが容易となるまで〜60℃の水浴中でゼラチンを含むコニカルチューブを配置し、暖かい。 注：温かいゼラチン溶液は、それが冷えると急速に硬化するため、急速に凍結する前に、次の手順をすべて実行。 </li><li>それを加熱した後、細胞培養フードに直ちにゼラチンを取る。 BEAにゼラチンでチューブを維持約60で予熱水とケル ゼラチン溶液の硬化を避けるためにC°。 </li><li> 2ミリリットルの血清学的ピペットを用いて、24平底プレートのウェル中に温かいゼラチン溶液0.6mlを堆積させる。このボリュームは、薄層の下側をカバーするのに十分である。穏やかに直ちに3D構造を破裂を避けるために異なるの2mlピペットを用いてゼラチン層の上に三次元細胞培養物を堆積させる。 注：ケアは、ゼラチンにPBSを配置していないこの段階で注意しなければならない。このような場合は、しかし、200μlのピペットを用いて、ゼラチンの上部からPBSを削除します。 </li><li>三次元細胞培養物をゼラチン層の表面上に配置された後の培養物の位置を乱さないように、慎重に、三次元細胞培養上温かいゼラチン混合物の別の0.6ミリリットルをピペット。第2層が配置された後、-80℃でゼラチン包埋3D細胞培養を凍結。 </li></ol> 6.スライスと解凍マウント番目質量分析イメージング用の電子ゼラチン包埋3D細胞培養<ol><li>冷凍庫から3D細胞培養物を含む24ウェルプレートを外します。ピンセットやメスでは、ウェルの側面ダウン優しくスライドするまで、あなたの手からの熱とプレートの底を温める。 </li><li>スムーズにセンターを解凍せずにゼラチンを解放、ピンセットやメスをスライドさせます。クライオスタットサポートに一滴の水を取り、支援にゼラチンディスクを接着するためにこれを使用する。 <ol><li>ゼラチン中に埋め込まれた三次元細胞培養物を-30℃でスライスに最も適している。使用前に70％エタノールクライオスタットブレードとガラスを清掃してください。ブレードの鈍化を防ぐために、ブレードまたは各3D細胞培養 - ゼラチンディスクの新しいブレードの別の部分を使用してください。 </li></ol></li><li> 3D細胞培養物が見えるようになるまで、クライオスタットを用いて、優しく余分なゼラチンをオフに直面している。 </li><li>この時点で、ゆっくりと12〜16ミクロンのセクションでスムーズな動きで3D細胞培養物をスライス。 注：スライスへの重要な要因は、ブレードにガラスの距離、ブレード角度、クライオスタットの温度、及び支持体上のディスクの角度を含むので、これらのすべては、一貫性のある結果を保証するためにチェックする必要があります。 </li><li>慎重にスライスを解凍し、適切に標識されたインジウムチタン酸化物（ITO）でコーティングされたガラススライド上にマウントし、デシケーターに保管してください。最高品質のために可能な限り迅速にスライスを使用してください。 </li></ol> 7.マトリックスアプリケーションおよびMALDIイメージング用サンプル調製<ol><li> MALDIイメージングに先立ち、適切なマトリックスとスライスを準備する。 <ol><li>小分子の分析のために、何回の洗浄工程は、一般的に必要とされない。無傷のタンパク質の検出のために、そのような信号をマスクする可能性脂質などの小分子を除去するために冷100％アセトン、カルノア液、または70％/ 95％イソプロパノールでスライスを洗浄し、24 - 26 </li><li>静かに時を超えない30秒間洗浄します。しないすべてのスライスを乱す。 </li></ol></li><li> 0.1％TFAと、有機溶媒と水の溶液中でマトリックスを準備する。そのようなαシアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸（CHCA）などの小分子は、60％ACNを使用し、40％H 2 O：0.1％TFA（10 mg / mlで）。タンパク質検出のためのそのようなシナピン酸（30 mg / ml）でのように、同じ溶媒溶液を使用する。シナピン酸の最適な溶解度のため、TFAを添加する前に、アセトニトリル中で最初に溶解する：H 2 O溶液。他のマトリックスを適宜用いることができる。 注意：マトリックスは、いくつかの異なる方法で適用することができるが、それはいくつかのマトリクスが使用できなくサンプルをレンダリングする、そのようなフェルラ酸として、ゼラチンと共結晶化さが分かっている注目すべきである。小さい結晶は、複数の分子種が検出され、生物学的な違いはなく、マトリックス効果に起因することを可能にし、より一貫性のある質量スペクトルを生成する。 </li><li>メソッドをhandspottingにより行列を適用します。 <ol><li> MATRの0.5μLを適用する先の細い注射器を使用してください三次元細胞培養スライス上にix溶液とマトリックスが結晶化さ許す。 </li></ol></li><li>また、エアブラシメソッドを使用します。マトリックス溶液と商用グレードのエアブラシを埋める。 <ol><li> 8〜12インチ離れスライドから噴霧器を保持するスライスで微細な噴霧を目指しています。パス間では、1分間に最高の結晶形成を可能にするためのマトリックスを乾燥させる。エアブラシの10〜20パスまでのマトリクス22の最適な層を製造するために必要とされている。 </li></ol></li><li>また、他の場所で詳述さ昇華法を使用しています。25,27 </li><li>かかわらず行列適用の方法のMALDI-MSI、前の少なくとも30分間デシケーター中で乾燥したスライド25 </li></ol> MALDI-TOFシステムを用いた8 MALDI-MSI分析（ すなわち、オートフレックスIII） 注：このセクションでは、MALDI-TOFイメージング実験のためのパラメータを設定するための指示やアドバイスが含まれています。アドインによってはtrumentメーカーやソフトウェア使用、プロセスが異なる場合があります。 <ol><li>しっかりとイメージにITO被覆されたスライドに付着した3D細胞培養スライスを75ミリメートル×25 mmスライドを保持するために作られ、アダプタのスライドを取り付けます。機器にスライドアダプタをロードします。 </li><li>問題の質量範囲のための適切な較正標準を選択することにより、MALDI-MSIのための楽器を準備します。小分子の尋問のために、使用されるマトリックス、α-CHCAに対応して検出された信号は、キャリブラントの一つの共通のグループである。タンパク質の分析のために、関心のある質量範囲内の既知のタンパク質標準（ すなわち、ユビキチン、トリプシノーゲン）を選択し、較正物質として3次元細胞培養に隣接してスポットする。メソッド開発を進める前に、機器を校正。 </li><li>画像化の前に、機器の製造業者が提供するソフトウェアを使用して、選択した質量範囲のためのデータ取得方法を開発する。のための図1と図2を参照してください小分子とタンパク質イメージング。小分子イメージングのために、最高の質量分解能のためのリフレクトロンモードを使用しています。 <ol><li> のm / z 100〜1,000の間と8,000- 25000 メートル/ zの間のタンパク質のための小分子データ取得のための質量範囲を調整します。楽器を持つ可能性が最も高い質量分解能を提供しながら、選択領域を包含するように質量範囲を調整します。 </li><li>レーザパワー、周波数、較正溶液と近くの「犠牲」の3D細胞培養スライスを用いたレーザーショットとスポットサイズの数を調整する。主計測器制御ソフトウェアでこれらの設定を確認します。 60％の電力、400レーザーショット、超小型スポットサイズ：推奨されるの出発点として、以下の設定を使用してください。これらの設定は、楽器やメソッド間で異なるので、それぞれ特定の楽器のための最高品質のスペクトルを与えるために、機器パラメータを最適化します。調整することができる他のパラメータは、検出器利得、サンプルレート、及び電子利得を含む。 Sイメージングソフトウェアで使用するためには、この方法をaveの（ すなわち 、自動実行方法はFlexImagingがに頼ること）。 注：検出を妨害しないように（再び計測器制御で見つかった）関心の質量範囲以下のイオンを抑制します。 </li><li>選択した質量範囲のためのタンパク質のデータ取得方法を開発する。上記で概説した同じ手順に従いますが、今回は中〜高質量範囲については、約3 kDaの上、リニア·モードを使用します。 NOTE：設定小分子法のために使用されるものとは異なる。 </li></ol></li><li>そのようなブルカーMALDI-TOFシステム用FlexImagingとして機器の製造元から提供イメージングソフトウェアを使用してセットアップ特定のMS機器パラメータ、。 <ol><li>前と保存されて開発された方法を使用して、新しいイメージングファイルとフォルダを作成します。そのようなラスタスポット（ステップ8.3.2または8.3.3にセットアップ）計測器制御方法を設定するサイズ（約200μm〜50μmのデフォルトからの変更）、およびPOSIなどの機器パラメータを選択します三次元細胞培養物を走査するる。 </li><li>順番に各レーザを移動し、試料上の3適切なティーチポイントを選択します。 「印刷画面」を使用して、MALDI-TOFレーザー制御ソフトウェアからの光学写真を入手します。 注：多くのイメージング·ソフトウェア·プログラムは、スキャナまたはしばしば器具カメラで得られるレーザが配置されている「教示」ソフトウェア、サンプルの光学写真を必要とする。 </li></ol></li><li>その後、イメージングソフトウェア（しない計測器制御）からの撮像処理を開始し、各スライスからマススペクトルを取得。特定の領域に局在ほとんどの3D細胞培養全体の質量と他の人を観察します。 </li></ol> 9.オプションデータ解析手法<ol><li>ターゲット分析のために、平均スペクトルに質量をクリックすることにより、スペクトルの手分析を行い、または（イメージングソフトウェアが自動的に特定のしきい値を超える質量を選択できるように例えば 、ABピーク）上位20％のしきい値をOVE。品質管理のため、マトリックスピークの分布や平均スペクトルを調べる。 </li><li>そのようなRやMatlabなどの数学ソフトウェアで抽出されたデータセットを統計分析を実行します。 <ol><li> ASCII形式でエクスポートシングルスペクトル、好みのソフトウェアにロードするための読み取り可能なテキストフ​​ァイル、。 </li><li> 、いくつかの異なるソフトウェアプログラムによって28読み取るためmzML形式のASCII、mzXML、個々のスペクトルに変換する- 31、または分析（.imgの）形式のファイル、MRIのような他のイメージング用途に使用される一般的なフォーマットとしてデータをエクスポート32分析のための2つのオープンソースのオプションはMSiReaderとバイオマップ32,33です。 </li><li>ファイルは、ソフトウェアによって読み取り可能なフォーマットにエクスポートされると、それぞれのソフトウェアの命令を経由してデータセットをロードします。ロード後、そのようなベースラインの除去および正規化として、取得後の処理を行う。 </li><li>このデータセットでは、statiがを実行そのようなカスタムスクリプトやMatlabなど18のようなソフトウェアでのアルゴリズムで構築いずれかを使用して、階層的クラスタリングの主成分分析としてsticalトリートメント。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

この記事は、Bruker Biospinが後援するマルチモーダル前臨床イメージングに関する特集号の一部です。 代表的な結果を得るために使用したMALDI-TOFシステムは、ブルカーAutoFlex IIIです。

上記に概説した方法を用いて、三次元細胞培養物を増殖させ、MALDI-MSIを分析することができる。ときに適切。9,10ケア、すなわち、何回も通過した低継代番号がされていない細胞を培養するために取られるべきで培養多くの不死化細胞株は、3D構造を形成する。一般的に、10および下部の継代数を有する細胞は、3次元細胞培養物を成長させるために最適である。従来のアガロース支持体に3次元細胞培養物を成長させることは、このシステムを試して三次元細胞培養物中の興味の研究グループのための費用効果の高い方法を提供する。この方法は、ほとんどの哺乳動物細胞培養室でない既にいくつかのコンポーネントを利用する。 3D細胞培養物は大きさや形状が一致しているように、細心の注意を払うことが、成長のためのアガロースプレートの準備に支払わなければならない。細心の注意を必要とするいくつかの態様は、気泡を混合物に捕捉されていないことを確認し、適切なメニスカスがそれぞれワットの底部に形成されていることが挙げられるエル。メニスカスが正常に形成されない場合、細胞は、非回転楕円形状又は小塊に成長することができる。また、ケアはスフェロイドとゼラチンにPBSを配置しないように注意する必要があります。この問題が発生した場合は、200μlのピペットを用いて、ゼラチンの上部からPBSを削除します。コストが要因ではない場合には、超低結合丸底プレートは、市販されており、これらの工程の簡略化を提供する。他の組織に埋め込む方法も費用がかかり、非質量分析両立させることができる一方で、ゼラチン - 埋め込みは、安価で汎用性の両方であることが示されている。上に概説準備戦略は、最高品質のデータを取得する3次元の細胞培養のために最適化されている。ゼラチン埋め込み質量分析と適合性であることが示されているが、このプロセスは、共結晶化に使用可能なマトリックスを狭めない。凍結したら、三次元細胞培養物は、それらが凍結融解されないようにヶ月間安定である。ゼラチンは凍結時に不透明になり、3Dセル培養は、類似した色であるので、スライスを補助するために、3D細胞培養の配置を記録するため、凍結前に推奨される。 スライドを調製する場合、マトリックスは、いくつかの異なる方法で適用することができるが、それはいくつかのマトリクスが使用できなくサンプルをレンダリングする、そのようなフェルラ酸として、ゼラチンと共結晶化さが分かっていることに留意すべきである。小さなマトリックス結晶は、より一貫性のある質量スペクトルを生成する。 handspottingマトリックスアプリケーションの最も単純な方法であるが、より大きな溶媒容量は、大きな結晶サイズと有意な分析物の移行をもたらすことができる。 質量分析計では、最初の分析に必要な専門知識が低下しているMALDI-MSIの技術の進歩。データ収集と分析は、初心者でもITO被覆スライドから高品質の情報を取得することができ、ほとんどのシステムでは単純である。近くの非画像値する3D細胞culturに最適化された機器パラメータを慎重に選択、エスは、高品質のデータを得るために重要である。例えば、レーザパワーを大きくするとピーク強度を増加させることができるが、レーザパワーの減少は、解像度を向上させ、より対称的なピーク形状を与えることができる。三次元細胞培養物は、最適なサンプルの品質を確保するためにスライスした後すぐに使用されるべきである。タンパク質シグナルの劣化（20 kDaの上記）、特に高質量領域において、適切なストレージ（デシケータ/ -80°Cの冷凍庫）なしで週以内に見ることができる。による需要のために、多くの異なる可視化ソフトウェアプログラムが開発され、研究公衆に自由にされている。ほとんどのイメージング質量分析計は、それぞれの機器で使用して独自のフォーマットを持つ単一の塊を可視化するために必要なソフトウェアがインストールされている。これらのソフトウェアプログラムは、単一の質量の画像を取得し、データをエクスポートするために使用することができる。ほとんどのソフトウェアはまた、目的の2つ以上の質量のオーバーレイを可能にする。さらに、MSIデータのための多くの異なった視聴者は、そのようなMSiReader ANとして、ダウンロードして無料ですのdバイオマップ。得32,33質量分析データは、最前線に有用な情報をもたらし、容易に取得後に処理することができる。 医薬品からの脂質へのタンパク質の、上記で概説したシステムは、三次元細胞培養構造全体で目的の分子の分布を評価するためのデータの迅速な取得を可能にする。連続切片は、3D細胞培養のスライスの各2D画像から構築することにより、画像全体の三次元構造をとることができる。プロトコルにおける技術やノートは、単層培養および動物モデル間のブリ​​ッジとしての三次元細胞培養を開始したい研究者に使用されるであろう。一度習得し、これらの技術は、彼らが選択したいずれかのサンプル画像への研究を可能にする、三次元細胞培養物、組織、および細胞培養物の複数のタイプに適用することができる。

質量分析イメージング(MSI)は、対象サンプル間の分子種の分布を調べるための強力な技術です。 研究者たちは、この技術を用いて、動物全体から単一細胞までの生物学的サンプルを画像化してきました。1–4 MSIを使用すると、従来の共焦点顕微鏡法のための追加の蛍光色素の開発や組織学のための染色を必要とする単一基質技術ではなく、一度に数百の分析物をイメージングできます。5–7 さらに、MSIはターゲットを絞った方法または発見ベースの方法で使用することができるため、化学種の分布間の重複を調べる魅力的なアプローチとなっています。 ここでは、三次元多細胞細胞培養の小さなサンプル(直径~1 mm)の増殖、調製、およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化/脱着(MALDI)イメージングの方法を紹介します。8-11
3D細胞培養は、従来の単層培養とin vivo腫瘍との間の仲介者として、生物学的コミュニティにとって特に興味深いものです。 その名前が示すように、3D細胞培養は、小さな無血管腫瘍結節で観察される微小環境の化学的勾配の多くを含む不均一な細胞凝集体であり、単層培養よりも天然の腫瘍環境にとってより現実的なモデルシステムとなっています。10 結腸、乳房、卵巣、前立腺、腎臓、肺組織に由来する細胞株など、多くのヒト細胞株を3D培養として増殖させることができます。10 三次元細胞培養のイメージングには、質量分析イメージングに一般的に使用される多くのサンプルよりも小さいため、慎重なサンプル調製が必要であるという固有の課題があります。7 ただし、これらの扱いやすいモデルシステムの利点は、動物モデルと比較して低コストで、成長と解析時間が短いことです。その結果、3次元細胞培養を含む研究は、従来の動物研究よりもハイスループットになる可能性があります。12-14
>jove_content<これらの利点の全てが、生物学研究における三次元細胞培養の人気を高める結果となりました。これらのシステムにおける分子の組成と空間分布の両方を探索するための新しい分析戦略を開発する必要があります。12,15–21 この原稿の目的は、質量分析イメージング法とサンプル調製の三次元細胞培養への適応について説明することです。

<table><tbody><tr><td>HCT116 細胞株</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-247</td><td>潜在的な危険性、取り扱いには注意</td></tr><tr><td>が必要 McCoy's 5A 培地</td><td>Gibco</td><td>16600-108</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA solution</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate緩衝生理食塩水</td><td>ギブコ</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン、無香気ノ</td><td>ックス</td><td></td><td>ほとんどの食料品店で シングルパケットの</td></tr><tr><td>ITOコーティングガラススライド</td>で利用可能 <td>デルタテクノロジーズ、リミテッド</td><td>CG-90IN-S115</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8982</td><td></td></tr><tr><td>シナピン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85429</td><td></td></tr><tr><td>0.3 mm 重力供給デュアルアクション エアブラシ ペイント スプレー ガン キット セット</td><td>RoyalMax エアブラシ</td><td></td><td>Amazon.com などのサイトで利用できる多くのオプション</td></tr></tbody></table>

3次元細胞培養モデルの質量分析イメージング用試料調製の戦略

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

三次元細胞培養は、生物学的研究にとって魅力的なモデルです。細胞培養の柔軟性と費用対効果を、組織の空間的および分子的複雑さの一部と組み合わせます。例えば、多くの細胞株は、適切なin vitro条件で3D構造を形成します。結腸がん細胞株は、無血管性腫瘍結節をin vitroで模倣した3D細胞培養スフェロイドを形成します。免疫組織化学やその他の古典的なイメージング法は、特定の分析種の分布をモニタリングするために一般的ですが、質量分析イメージングは、分子のクラスの分布を偏りなく調べます。 MALDI質量分析イメージングは、もともとヒトまたは動物モデルから得られたサンプルを調べるために開発されましたが、このレポートでは、サンプル調製戦略の改善を含むin vitro 3次元細胞培養の分析について説明しています。ここでは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析(MALDI-MS)イメージングによる3D細胞培養の増殖、回収、切片化、洗浄、および分析の方法について説明します。 大腸がんの3D細胞培養をモデルシステムとして用いたこのプロトコルは、MALDI-MSIを用いて3D細胞培養システム全体で分析物を偏りなくモニタリングする能力を示しています。

MSI画像は、3D細胞培養物中の多数の異なる分子量分布を明らかにする可能性がある。上記で概説した方法を用いて、小分子（ 図1）からの大きなタンパク質（ 図2）の種は、培養にわたって追跡することができる。これらの結果は、MSiReader図32の結果は、関心領域全体走査領域のいずれかで可視化ソフトウェアで3D細胞培養を横切る単一の注目イオンを分析することができる無料のツールと単一イオンの視覚化を示す。さらに、ほとんどのソフトウェアは自動的に発見の努力を支援する可能性がある、ユーザーが設定した一定の閾値を超えるイオンを可視化します。単一イオンマップが得られると、ほとんどのソフトウェアは、イオンの共局在を表示するために画像をオーバーレイする能力を含む。いずれかのアプローチを発見ベースまたは標的化様式で、質量分析イメージングは​​、3次元細胞培養物を分析するための強力なツールである。 図3D細胞培養増殖および切片。左）収穫前に14日目に見て、無傷の結腸直腸HCT-116三次元細胞培養構造の光学画像の1代表的な結果 。右大腸3D細胞培養雪解けの約赤道スライスの）光学画像は、撮影用のITO被覆スライド上にマウントした。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig2highres.jpg" /> 低質量（小分子）の範囲でα-CHCAを用いて達成図3D細胞培養の赤道部分の小分子MALDI-MSIの2。代表的な結果。トップ）の平均質量スペクトル。の下）代表的な画像単一の質量：主に3次元細胞培養及び主に3D細胞培養の縁に局在429.7 メートル/ zの内部に局在327.8 メートル/ zの 。破線は回転楕円体のおおよそのエッジを示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig3highres.jpg" /> 図3D細胞培養。トップ）は、より高い（タンパク質）の質量範囲内シナピン酸を用いて達成さの平均質量スペクトルの赤道部分のMALDI-MSIによるタンパク質イメージングの3代表的な結果 。ボトム）単一の質量の代表的な画像：主に回転楕円体の端に局在10871 メートル/ z、およびより多くの回転楕円体の内部に向かってローカライズされた12184 メートル/ zの 。破線は回転楕円体のおおよそのエッジを示し。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

不死化された癌細胞株は、3次元細胞培養物、生物学的研究のための貴重なモデルとして成長させることができる。このプロトコルは、サンプル調製プラットフォームの改善を含む、三次元細胞培養物の質量分析イメージングを記述する。このプロトコルの目的は、質量分析イメージング解析のために3次元細胞培養物を調製するためにユーザーに指示することである。

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

この手順の全体的な目的は、3次元細胞培養を調製し、質量分析イメージングによって分析することです。まず3次元細胞培養を構築し、目的のサイズまで成長させます。次に、3次元細胞培養を回収し、ゼラチンに包埋します。次に、3次元細胞培養物をクライオスタットを用いて-30 °Cで薄切し、導電性スライドに貼付します。最終ステップとして、MALDI-MSI装置を用いて切片を分析し、検出された分子の解析を行います。最終的に、質量分析イメージングを用いて、3次元細胞培養におけるさまざまなバイオ分子クラスの分析物の分布変化を明らかにします。この手法の既存の質量分析顕微鏡やオートラジオグラフィーに対する主な利点は、抗体ラベルを用いることなく、タンパク質、脂質、薬剤、代謝物などの複数の分析物を単一の実験で検出および局在化できることです。本手順のデモンストレーションを行うのは、Dorothy Alf Wheat craft、私（ポストドク）、およびHammanラボの大学院生であるShin Liです。この手順を開始する前に、HCT 116大腸癌細胞株などの適切な細胞株を二次元単層培養します。その後、50 mLコニカルチューブに入れた10 mLの標準培地に、0.19 gのarosを添加します。穏やかに混ぜ合わせて十分に混和させ、その後、マルチピペットを用いてウォーターバスで20分間オートクレーブ処理したAgros培地混合液を、平底96ウェル培養プレートの中央60ウェルに50 µLずつ分注します。プレートの外周部のウェルは蒸発率がわずかに高いため、これらの外周部にはAgros培地の代わりに1×リン酸緩衝生理食塩水を200 µL注入します。内側のウェルにaros混合物を添加した後、細胞を添加する前にプレートを約37 °Cまで冷却させます。ここで、適切な細胞懸濁液 200 µLをarosコーティングした96ウェルプレートに添加し、プレートを密閉して、細胞増殖のために5% CO₂、37 °Cの加湿インキュベーターに設置します。インキュベーション後、aros底部の小さな3次元細胞培養物の周囲から、古い培地を注意深く吸引して培地を交換します。次に、3次元細胞培養の上に新鮮な培地を200 µL静かに加えます。高純度水を用いて、約175 mg/mLのゼラチン溶液を調製します。溶液が粘性を帯びて扱いづらくなった後、ゼラチンを激しく混ぜ合わせます。チューブを約60°Cのウォーターバスに入れ、溶液が透明になり、容易に吸引できるようになるまで温めます。2 mLセロロジカルピペットを用いて、温めたゼラチン溶液を0.6 mLずつ24ウェル平底プレートの各ウェルに分注します。3次元構造を破壊しないよう、別の2 mLピペットを使用して、洗浄済みの3次元細胞培養物をゼラチン層の上に直ちに配置します。細胞培養物をゼラチン層の表面に配置した後、細胞の位置を乱さないように、温めたゼラチン混合液をさらに0.6 milliliters、慎重にピペットで滴下します。その後、ゼラチンに埋め込まれた三次元細胞培養物をminus 80 degrees Celsiusで凍結させます。細胞培養された24ウェルプレートをフリーザーから取り出した後、ピンセットがウェルの側面を穏やかに滑り降りるようになるまで、プレートの底を手のひらで温めます。次に、中心部を融解させることなく、ピンセットをディスクの周囲にスムーズに滑らせてゼラチンを剥離させます。クライオスタットのサポートに水を1滴加え、ゼラチンディスクをサポートに密着させます。その後、クライオスタットに入れて凍結させます。余分なゼラチンを削り落として三次元細胞培養組織を露出させた後、滑らかな動作でゆっくりと12～16 µmの厚さにスライスします。スライスを解凍後、酸化インジウムスズ（ITO）コーティングガラススライドにマウントします。スライドにラベルを貼り、タンパク質をそのままの状態で検出するため、デシケーター内で保存します。その後、シグナルを遮る可能性がある脂質などの低分子を除去するため、スライスを冷アセトンで洗浄します。有機溶媒と0.1%トリクロロ酢酸を含む水溶液中でマトリックスを調製します。細いチップのシリンジを用いて、3次元細胞培養スライス上にマトリックス溶液を0.5 µL塗布します。マトリックスを結晶化させた後、MALDI MSIを行う前に、デシケーター内でスライドを少なくとも30分間乾燥させます。この段階での解析では、3次元細胞培養スライスをイメージングするため、75 mm × 25 mmのスライドを確実に固定できるように作られたアダプターにスライドを装着します。次に、スライドアダプターを装置にロードします。適切なデータ収集法を設定した後、データ収集用の質量範囲を、低分子化合物では100〜1,000 m/z、タンパク質では800〜5,000 m/zに調整します。次に、校正溶液と、その近傍にある犠牲用の3次元細胞培養スライスを用いて、レーザー出力、周波数、ショット数、およびスポットサイズを調整します。この設定を、装置メーカー提供のイメージングソフトウェアに保存します。前述した通り、選択した質量範囲に合わせてタンパク質データ収集法を構築します。次に、イメージングソフトウェアを使用して、特定のMS装置パラメータを設定します。装置パラメータを選択し、3D細胞培養の走査範囲を決定するため、装置制御方法の位置を設定します。続いて、サンプル上の適切なティーチポイントを3か所選択し、レーザーをそれぞれのポイントに移動させます。次に、MALDI-TOFレーザー制御ソフトウェアから、プリントスクリーン機能を用いて光学写真を取得します。その後、イメージングソフトウェアからイメージングプロセスを開始し、標的解析のために各スライスから質量スペクトルを取得します。平均スペクトル内の質量をクリックすることで、スペクトルの手動解析を行います。最後に、抽出したデータセットを用いて数学ソフトで統計解析を行います。質量分析イメージングは、3次元細胞培養における多くの異なる分子分布を明らかにできる可能性があります。前述の方法を用いることで、低分子から巨大タンパク質までの種を培養全体にわたって追跡することができます。このビデオを視聴することで、3次元細胞培養の調製、切片作成、および質量分析イメージングによる分析方法について十分に理解できるはずです。

sample-preparation-strategies-for-mass-spectrometry-imaging-3d-cell

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JoVE Journal

Bioengineering

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3次元細胞培養モデルの質量分析イメージング用試料調製の戦略

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