화학 물질 안전 검사 및 시스템 생물학 데이터 생성을 위해 발생 독성 시험 법을 바탕으로 인간 다 능성 줄기 세포

이 절차의 전반적인 목적은 인간 배아줄기세포와 전사체 연구를 기반으로 한 두 가지 인 비트로(in vitro) 발달 독성 시험 시스템을 설명하는 것입니다. 이는 먼저 생쥐 배아 섬유아세포 상에서 인간 배아줄기세포를 배양함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 인간 배아줄기세포가 세 가지 배엽의 모든 세포를 생성할 수 있는 배아체(Embryoid bodies)를 형성하도록 하거나, 이를 신경외배엽 전구세포로 분화시키는 것입니다.

다음으로, 분화 과정 중에 배아체 또는 신경외배엽 전구세포를 다양한 농도의 관심 화합물로 처리합니다. 마지막 단계는 세포의 생존력을 평가하고 RNA를 분리하는 것입니다. 최종적으로 전사체 마이크로어레이 분석을 사용하여, 관심 화합물로 처리된 세포의 RNA 발현 변화를 처리하지 않은 대조군 세포와 비교하여 나타냅니다. 인간 신세포 및 DNA 매크로 영역을 기반으로, 우리는 인간과 관련이 있는 발달 독성 효과를 모니터링할 수 있는 인비트로(in vitro) 방법론을 구축하였습니다.

이 방법론은 제약 및 화학 산업에서 잠재적 약물과 환경 독성 물질의 안전성 스크리닝에 적용될 수 있습니다. 이 방법은 화학 물질이 매우 초기 단계의 신경 발달에 미치는 영향과 같이, 발달 독성 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 먼저, 실온에서 줄기세포 배지 보충제를 해동한 후, 기초 줄기세포 배지 400 milliliters에 보충제 100 milliliters를 첨가하십시오.

다음으로, 얼음 위에서 기저막 매트릭스를 해동한 후, 제조사의 권장 사항에 따라 보충된 부피의 매트릭스를 24 mL의 냉각된 dmm. F 12 기초 배지에 첨가하십시오. 피펫팅으로 부드럽게 위아래로 섞어 용액을 만든 다음, 이 혼합액 2 mL를 12개의 개별적인 6 cm 플레이트에 각각 넣으십시오. 매트릭스가 플레이트에 코팅될 수 있도록 플레이트를 상온에서 1시간 동안 배양하십시오.

그런 다음 배지를 제거하고 줄기세포 배지 2 mL를 첨가합니다. 다음으로, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 준비된 마우스 배아 섬유아세포 피더 층에서 배양된 인간 배아 H9 세포가 포함된 컨플루언트 플레이트 4개를 인큐베이터에서 꺼냅니다. 실체 현미경 하에서 1 mL 피펫 팁을 사용하여 플레이트에서 분화된 콜로니를 제거합니다.

미분화 콜로니는 경계가 뚜렷하고 세포가 조밀한 반면, 분화된 세포는 경계로부터 퍼져 나가기 시작하며 세포의 크기가 더 큽니다. 배지를 흡입하여 제거하고 4 mL의 PBS로 세포를 세척하십시오. 그 후, 실체현미경 하에서 줄기세포 배지 2 mL를 첨가합니다.

26 gauge 바늘을 사용하여 콜로니를 각각 6~9조각으로 자르고, 1 mL 피펫 팁으로 덩어리를 긁어냅니다. 잘린 콜로니를 50 mL falcon tube에 조심스럽게 수집한 후 200 G에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛화합니다. 이어서 상층액을 흡입하여 제거하고 12 mL의 줄기세포 배지에서 세포를 재부유시킵니다.

세포 현탁액 20 µL를 유리 슬라이드 위에 떨어뜨리고 현미경으로 응집체의 수를 측정합니다. 현탁액의 농도를 mL당 150개 응집체가 되도록 조절한 후, 각 6 cm 플레이트에 현탁액 2 mL를 첨가합니다. 플레이트를 전후좌우로 흔들어 세포를 균일하게 분산시킨 다음, 세포 배양 인큐베이터에서 이틀 간격으로 플레이트를 배양합니다.

배지를 조심스럽게 교체합니다. 분화된 콜로니를 제거한 후, Vbo 96웰 플레이트의 각 웰에 멸균된 5% 블록 공중합체 용액 40 µL를 첨가하고 상온에서 45분 동안 배양합니다. 콜로니가 confluence 상태인 플레이트를 배양기에서 꺼내 스테레오 현미경 하에서 1 mL 피펫 팁으로 분화된 콜로니를 채취합니다. 그 다음 플레이트에서 배지를 흡입하여 제거하고 4 mL의 PBS로 세포를 부드럽게 세척합니다.

다음으로, 각 플레이트에 random differentiation medium 2 mL를 추가합니다. passage tool을 사용하여 H9 세포 콜로니를 균일한 크기의 덩어리로 절단합니다. cell scraper로 덩어리를 긁어내어 50 mL falcon tube centrifuge에 조심스럽게 수집합니다.

콜로니를 400 ×g에서 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 흡입 제거하고 세포를 무작위 분화 배지에 1,000 clumps/mL 농도로 재부유합니다. 다음으로, 멀티채널 피펫을 사용하여 V-bottom 96-well 플레이트에서 블록 공중합체를 흡입 제거하고, 각 웰에 콜로니 현탁액 100 µL를 첨가합니다. 플레이트를 4 °C에서 4분 동안 400 ×g로 원심분리하여 V자형 웰 바닥에 클럼프를 응집시킵니다. 그 후 플레이트를 인큐베이터에 넣고 4일 동안 배양합니다. 와이드 보어 200 µL 팁을 사용하여 96-well 플레이트에서 배아체(embryoid bodies)를 옮겨 멸균된 122 mm 정사각형 플레이트에 넣습니다.

다음으로, 10 milliliter 멸균 세롤로지컬 피펫을 사용하여 사각 플레이트에서 배아 본체를 15 milliliter 팔콘 튜브로 옮깁니다. 배아 본체가 가라앉을 때까지 2분 동안 기다린 후, 상층액을 흡입하여 제거하고 5 milliliter의 PBS로 배아 본체를 세척합니다. 다시 배아 본체가 가라앉을 때까지 2분 동안 기다린 후 상층액을 흡입하여 제거합니다.

이번에는 배아체(embryo bodies)를 5 mL의 무작위 분화 배지에 다시 현탁합니다. 다음으로, 배아체를 10 cm 박테리아 플레이트로 옮기고 무작위 분화 배지 10 mL를 추가로 넣습니다. 플레이트를 수평 진탕기(horizontal shaker)에서 37 °C, 5% CO2 조건으로 배양합니다.

50 RPM에서 5일 차, 9일 차 및 14일 차의 대표적인 배아 본체가 나타나 있습니다. 격일로 배지를 조심스럽게 교체하며, 15 mL 전체를 새로운 무작위 분화 배지로 교체하십시오. 분화에 미치는 약물 효과를 평가하려면, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 5일 차부터 10일 동안 배지에 약물을 첨가하기 시작하십시오.

멸균 피펫을 사용하여 10 centimeter 플레이트에서 배아 본체를 수집해 15 milliliter falcon 튜브에 담습니다. 2분 동안 가라앉힌 후 상층액을 흡입하여 제거합니다. 5 milliliter의 PBS로 세척한 후 nuclease free 1.5 milliliter 튜브로 옮깁니다.

가라앉을 때까지 기다린 후 상층액을 흡입하여 제거합니다. 배아 본체를 1 mL의 triol 시약에 현탁시키고, 1 mL 주사기에 24게이지 바늘을 장착하여 용액을 약 15회 통과시켜 세포를 파쇄합니다. 다음으로, 각 시료에 200 µL의 클로로포름을 추가합니다.

내용물을 짧게 볼텍싱한 후, 4°C에서 12,000 G로 15분 동안 샘플을 원심분리합니다. 다른 층이 섞이지 않도록 주의하며 상층액을 1.5 mL 튜브에 수집합니다. 그다음 상층액에 동일한 부피의 냉각된 70% ethanol을 첨가하고 흔들어 내용물을 부드럽게 혼합합니다. 혼합액 700 µL를 미니 스핀 컬럼에 옮기고 제조사의 지침에 따라 최종 용출 단계에서 RNA를 정제합니다.

스핀 컬럼에 nuclease free water 22 µL를 가하고 12,000 G에서 1분 동안 원심분리합니다. 그 후 컬렉션 튜브를 제거하고 RNA를 얼음에 보관하십시오. confluent 상태의 T 25 플라스크당 H9 세포에 미리 데운 disc space 1 mL를 첨가하고, 플라스크를 37 °C에서 9분 동안 배양합니다.

그런 다음 미리 데워둔 세척 배지 2 mL를 처리된 세포에 추가하고, 5 mL 피펫을 사용하여 부드럽게 5회 파이펫팅합니다. 이후 세포 현탁액을 팔콘 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 플라스크를 9 mL의 세척 배지로 세척한 후 이를 세포가 들어 있는 튜브에 추가합니다. 500 G에서 3분 30초 동안 원심분리하여 세포를 회수합니다. 그 후 상층액을 제거하고 세포를 10 mL의 세척 배지에 재현탁합니다. 세포를 다시 500 G에서 3분 30초 동안 원심분리한 다음, 상층액을 제거하고 세포를 4 mL의 인간 배아줄기세포 배지에 재현탁합니다. 세포 현탁액 0.5 mL와 신선한 배지 4.5 mL를 유사분열이 억제된 마우스 배아 섬유아세포가 포함된 PBS 세척된 새로운 T 25 플라스크에 추가합니다.

플라스크의 배지를 매일 교체하십시오. 10 cm 디시를 PBS에 희석한 0.1% gelatine으로 코팅하고 37 °C에서 30분 동안 인큐베이션합니다. 그 다음, 배지를 제거하여 인간 배아 줄기 세포를 수확하고, 세포가 떨어져 나오는 동안 T 25 플라스크에 acuta 1 mL를 첨가하십시오.

6.6 mL의 차가운 배지를 330 µL의 냉동 기저막 매트릭스(basement membrane matrix)에 추가합니다. 해당 용액을 40 µm 세포 스트레이너로 여과한 후, 여과된 용액 1 mL를 6-웰 플레이트의 각 웰에 분주하여 덮습니다. 인간 배아 세포를 Accutane으로 30분간 배양한 후, 코팅된 플레이트에 세포를 플레이팅합니다. 1.5 mL의 Hess 배지를 추가하여 반응을 중단시킵니다.

플라스크에서 세포를 긁어낸 후, Hess 배지 8 mL를 추가로 첨가합니다. 10 mL 피펫으로 부드럽게 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 만든 다음, 40 µm 세포 스트레이너로 세포를 여과하고 500 G에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세포를 배지 10 mL에 재현탁한 후, 500 G에서 다시 3분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거하고, 최종 농도가 10 µM인 Rock inhibitor Y 2 7 6 3 2가 포함된 Hess S 배지 10 mL에 세포를 재현탁합니다.

다음으로, 젤라틴 코팅 배양 접시에서 상층액을 제거하고, 젤라틴 코팅 배양 접시 위의 세포 현탁액을 37°C에서 정확히 1시간 동안 배양합니다. 이 단계 동안 하이포플라스트(hypoplast)는 젤라틴 코팅 플레이트에 가라앉고, 인간 배아 줄기세포는 부유 상태로 남게 됩니다. 부유 시간은 매우 중요한데, 배양 시간이 너무 길면 줄기세포가 뭉치게 되고, 너무 짧으면 섬유아세포가 부착될 때 일부의 섬유아세포만 제거되기 때문입니다.

플레이트에 있는 배지를 사용하여 부착되지 않은 줄기세포를 플레이트에서 부드럽게 씻어냅니다. 10 milliliters의 Hess 배지로 플레이트를 두 번째로 세척하여 세포를 모은 후, 500 G에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 10 micromolar의 rock inhibitor Y 2, 7, 6, 3, 2 및 10 nanograms per milliliter의 fiberblast growth factor two가 포함된 약 4 milliliters의 조건화 배지에 세포를 재현탁합니다. 다음으로, 세포를 trian blue와 혼합한 후 hemo cytometer 플레이트에서 세포 수를 측정합니다.

기저막 형성 전 플레이트당 제곱센티미터당 18, 000 cells의 밀도로 세포를 분주합니다. Membrane coated plates의 각 웰에 1.5 milliliters의 배지를 넣어 세포를 덮고, 37 °C 및 5% carbon dioxide 조건에서 배양합니다. 24시간 후, 배지를 교체합니다. 다시 24시간이 지나면, 10 nanograms per milliliter의 fibroblast growth factor 2만 보충된 신선한 conditioned medium으로 배지를 교체하여 72시간 동안 배양합니다.

세포를 파종한 후, 배지를 knockout serum replacement 배지로 교체합니다. 이 시점을 분화 0일 차로 정의합니다. 이후 3일 동안 매일 새로운 배지로 교체하여 세포를 배양합니다.

4일차와 5일차에 배지를 교체할 때, 25%N two 보충 배지와 75% knockout serum replacement로 구성된 배지를 추가하십시오. 6일차에는 배지를 교체한 후 분석을 위해 세포를 수확합니다. 배아체(embryo bodies)는 다양한 연구에 활용될 수 있습니다.

다음은 다양한 농도의 methyl mercury가 세포 생존율에 미치는 영향을 보여주는 세포독성 연구 사례입니다. 이 그래프를 통해 14일간 노출 후 24 micromolar 지점에서 10%의 세포 사멸이 발생하였고, 1.61 micromolar 농도에서 50%의 세포 사멸이 발생했음을 확인하였습니다. 세 가지 methyl mercury 처리군의 배아 몸체에서 분리한 RNA를 마이크로어레이로 분석하여 광범위한 바이오마커를 조사하였습니다.

25 µM 수은에 노출된 샘플은 빨간색으로 표시되었습니다. 1 µM 메틸수은에 노출된 샘플은 파란색으로, 대조군 RNA는 녹색으로 표시되었습니다. 이 주성분 분석(PCA) 맵은 각 처리군 간의 유전적 특성이 유의미하게 다름을 보여주며, 1 µM 농도의 메틸수은에 노출되었을 때 276개 이상의 유전자에서 2배 이상의 발현 변화가 나타났습니다.

그 중 30개의 유전자는 25 µM의 저농도 처리군에서도 변형되었습니다. 이 히트맵을 통해 1 µM 처리군에서 변형된 유전자 중 233개는 발현이 감소(downregulated)되었으며, 처리로 인해 발현이 증가(upregulated)된 유전자는 43개뿐임을 알 수 있습니다. 트리아졸(triazole) 또는 개발 단계의 개미를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 실험 절차를 수행하는 동안 안전 고글과 화학 저항성 장갑을 착용하고 모든 트리아졸 관련 작업을 흄 후드(fume hood) 내에서 수행하는 등의 예방 조치를 항상 고려해야 함을 잊지 마십시오.

이 절차를 수행한 후, 표현형 앵커링(phenotypic anchoring)과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 염색이나 페로스(feros) 형성 등 튜브 형성 결과에 영향을 줄 수 있는 다른 방법들을 병행하여 수행할 수 있습니다.