Ein Fisch-Fütterung Labor Bioassay die antipredatory Aktivität von Sekundärmetaboliten aus dem Gewebe mariner Organismen beurteilen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die anti-räuberische Aktivität von Sekundärmetaboliten aus dem Gewebe von Meeresorganismen zu bewerten. Hallo, ich bin Dr. Joseph Pollock von der University of North Carolina Wilmington, und ich werde von dem Doktoranden Michael Marty begleitet, der als Teamleiter dieses Videos über die Durchführung von Bioassays zum Testen der chemischen Abwehr in den Geweben von Meeresorganismen erstellt hat. Wir begannen in den späten 1980er Jahren mit der Entwicklung der Methoden, die Sie gleich sehen werden.

Zu dieser Zeit wiesen Naturstoffchemiker den Sekundärmetaboliten ökologische Rollen zu, ohne dass es einen experimentellen Nachweis gab. In der Zwischenzeit extrapolierten Ökologen defensive Rollen aus Toxizitätstests, die keine ökologische Relevanz hatten. Hier stellen wir einen Ansatz vor, der entwickelt wurde, um die anti-räuberische Aktivität der Sekundärmetaboliten aus Geweben von Meeresorganismen zu bewerten.

Dieser Ansatz erfüllt vier wichtige Kriterien für die Fütterung von Bioassays. Erstens, wir verwenden einen geeigneten generalistischen Räuber. Zweitens extrahieren wir erschöpfend organische Metaboliten aller Polaritäten aus dem Gewebe.

Drittens haben wir diese Metaboliten in ein experimentelles Lebensmittel in der gleichen volumetrischen Konzentration gegeben, die im Organismus zu finden ist. Und viertens bieten unser experimentelles Design und unser statistischer Ansatz eine aussagekräftige Metrik, um zu zeigen, ob relativ geschmacklos ist. In diesen Fütterungsexperimenten verwenden wir den Blaukopf-Thoma von fossum, einen Modell-Raubfisch, der sich für Assays mit Geweben von karibischen wirbellosen Meerestieren eignet, da diese Fischart in karibischen Korallenriffen verbreitet ist und dafür bekannt ist, eine breite Palette von benthischen Wirbellosen zu beproben.

Nun wird Michael das Protokoll im Detail beschreiben. Zuerst muss das Gewebe entnommen werden. Eine Eins-zu-Eins-Mischung aus Dichlorid, Methan und Methanol wird in ein Messzentrifugenröhrchen gegeben, bis ein Endvolumen von 30 Millilitern

Schneiden Sie dann Gewebestücke von Ihrem Zielorganismus ab. Dies kann mit frischem oder gefrorenem Gewebe erfolgen. Wir arbeiten mit Schwämmen, daher wird diese Filmvorführung den orangefarbenen Elefantenohrschwamm, Alus und Plet Roadies zeigen.

Möglicherweise musst du sehr kleine Stücke Gewebe schneiden, um das richtige Volumen zu erhalten. Mit der volumetrischen Verdrängung können Sie genau 10 Milliliter Gewebe extrahieren, das Röhrchen verschließen und umdrehen, dann in dieser Zeit vier Stunden lang rühren, Wasser verbindet sich mit dem Methanol und die resultierende Methanol-Wasser-Phase trennt sich von der Di-Chlor-Methan-Phase. Das Gewebe wird abwechselnd jedem Extraktionsmedium ausgesetzt, während die Röhrchen gerührt werden.

Nach dieser Extraktionsphase werden zwei unterschiedliche Phasen erkennbar sein. Die polare Phase von Methanol und Wasser wird mit einer Passerpipette auf die unpolare Phase von Chlormethan aufgesetzt. Der Di-Chlormethan-Extrakt aus dem Messzentrifugenröhrchen in einen Rundkolben, das Messzentrifugenröhrchen, sollte im Kühlschrank aufbewahrt werden.

Befestigen Sie für die nächsten Schritte den Rundkolben an einem Rotationsverdampfer für alle Schritte am Rotationsverdampfer. Achten Sie darauf, dass die Temperatur des Wasserbades unter 40 Grad Celsius bleibt. Nach den grundlegenden Betriebsverfahren für den Rotationsverdampfer wird das Dichlormethan in dem Rundkolben getrocknet und der getrocknete unpolare Extrakt mit einer sehr geringen Menge Dichlormethan resuspendiert.

Etwas Rühren oder Schwenken kann hilfreich sein, um getrocknetes Material von den Seiten des Rundkolbens zu entfernen. Anschließend wird der Chlormethanextrakt aus dem Rundkolben in ein 20-Milliliter-Szintillationsfläschchen überführt. Anstatt die Kappe auf das Szintillationsfläschchen zu setzen, befestigen Sie einen Rotationsverdampferadapter an das Szintillationsfläschchen und verdampfen Sie wieder bis zur Trockenheit. Auf einem Rotationsverdampfer kann das Szintillationsfläschchen mit dem getrockneten unpolaren Extrakt während der nächsten Schritte im Kühlschrank aufbewahrt werden.

Zurück zum graduierten Zentrifugenröhrchen, das das Gewebe und den Methanol-Wasserextrakt enthält, verwenden wir ein selbstgemachtes Instrument, das das Extraktionsmedium durch Kompression aus dem Gewebe drückt und das Gewebe komprimiert. Anschließend den Methanol-Wasser-Extrakt in den Rundkolben umfüllen und gekühlt im Kühlschrank lagern. Geben Sie Methanol in das graduierte Zentrifugenröhrchen, bis das Gewebe für eine zweite Extraktion von zwei bis sechs Stunden Dauer untergetaucht ist.

Sobald die zweite Methanolextraktion abgeschlossen ist, nehmen Sie den gekühlten Rundkolben aus dem Kühlschrank, komprimieren Sie den Inhalt des graduierten Zentrifugenröhrchens und überführen Sie diesen neuen Methanolextrakt in den ursprünglichen Rundkolben, der den Methanolwasserextrakt von früher enthält. Wenn zu diesem Zeitpunkt Bedenken bestehen, dass das Gewebe nicht vollständig extrahiert wurde, kann der zwei- bis sechsstündige Schritt der Methanolextraktion wiederholt werden. Den Rundkolben an einen Rotationsverdampfer anschließen und das Methanol wie zuvor abtrocknen.

Denken Sie daran, die Temperatur des Wasserbades unter 40 Grad Celsius zu halten. Der Rundkolben enthält einen wässrigen Extrakt, der mit dem getrockneten unpolaren Extrakt in dem 20-Milliliter-Szintillationsfläschchen kombiniert werden muss. Übertragen Sie daher den Inhalt des Rundkolbens in das 20-Milliliter-Szintillationsfläschchen.

Falls erforderlich, spülen Sie den Rundkolben mit einer kleinen Menge Methanol aus, um den restlichen Extrakt aufzufangen. Das Szintillationsfläschchen enthält nun den getrockneten unpolaren Extrakt und den polaren Extrakt. Der polare Extrakt ist jedoch in einem kleinen Volumen Flüssigkeit suspendiert.

Mit einem Vakuumkonzentrator bei schwacher Hitze den wässrigen Extrakt bis zur Trockenheit verdampfen. Das Szintillationsfläschchen enthält nun einen trockenen, rohen organischen Extrakt aus 10 Millilitern Gewebe, bläst das Fläschchen mit Farbstoffstickstoffgas nieder und lagert es im Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius. Um die Schmackhaftigkeit dieser Gewebeextrakte zu testen, müssen sie zunächst in einer Lebensmittelmatrix rekonstituiert werden, die ernährungsphysiologisch mit dem Zielorganismus vergleichbar ist.

Ringe aus Tintenfischmantel sind eine geeignete Proteinquelle für Bioassays von wirbellosen Geweben und können leicht zu einem lyophilisierten Pulver präpariert werden. Für diesen Bioassay werden gefrorene Ringe des Tintenfischmantels in warmes, deionisiertes Wasser gelegt. Nach dem Auftauen etwas Wasser umfüllen und die Ringe in einen Mixer geben.

Gründlich auf höchster Stufe mixen, bis der Tintenfischmantel eine zähflüssige Flüssigkeit wird. Füge Wasser hinzu, wenn das Material zu dick ist, um es zu verblenden. Gießen Sie eine dünne Schicht verflüssigten Tintenfischmantel auf ein flaches Backblech und verteilen Sie es gleichmäßig.

Lege das Backblech bei minus 20 Grad Celsius in einen Gefrierschrank. Das Blatt mit gefrorenem Tintenfisch muss in kleinere Stücke gebrochen werden, um den Prozess der Gefriertrocknung zu erleichtern. Kleinere Stücke sind besser, weil sie schneller trocknen.

Im Gefriertrockner. Legen Sie die zerbrochenen Stücke des gefrorenen Tintenfischs in die Kammer und befolgen Sie die Bedienungsanleitungen für den Gefriertrockner. Nach der Gefriertrocknung müssen die Tintenfischstücke pulverisiert werden.

Dies kann mit einem Mixer erreicht werden. Die getrockneten Tintenfischstücke in den Mixer geben und auf hoher Stufe laufen lassen, bis das Material als gleichmäßiges Pulver erscheint. Der nächste Schritt sollte in einem Abzug durchgeführt werden, um das Einatmen von partikelförmigem Tintenfischstaub zu reduzieren.

Gießen Sie das gefriergetrocknete Tintenfischpulver in ein rotierendes Blumensieb. Halten Sie einen Behälter unter das Sieb, um das Pulver aufzufangen, das durch das Sieb läuft. Drehen Sie die Kurbel, um das gefriergetrocknete Tintenfischmaterial zu sieben.

Große Stränge des Bindegewebes, die in den vorangegangenen Schritten nicht ausreichend vermischt wurden, werden im Sichter zurückgehalten, um bei Bedarf mit einem Trichter ein feineres Pulver zu erhalten, das gefriergetrocknete Tintenfischpulver in einen verschließbaren Behälter zu überführen, mit Farbstoffstickstoffgas abzublasen und gefroren bei minus 20 Grad Celsius zu lagern. Nachdem wir das gefriergetrocknete Tintenfischmantelpulver vorbereitet haben, sind wir nun bereit, eine Charge der Assay-Lebensmittelmischung herzustellen. Wenn Sie mehrere aufeinanderfolgende Assays am selben Tag durchführen, ist es praktisch, eine große Charge der Lebensmittelmischung herzustellen.

Hier demonstrieren wir den Herstellungsprozess für eine Mischung von 100 Millilitern Volumen, wobei wir mit einem sauberen Molkeschiffchen drei Gramm Alginsäure und fünf Gramm gefriergetrocknetes Tintenfischmantelpulver ausmassieren. Geben Sie diese trockenen Zutaten in ein 150-Milliliter-Becherglas, bevor Sie Wasser hinzufügen. Rühre die trockenen Zutaten vorsichtig mit einem Mikrospatel um, um sie miteinander zu vermischen.

Fügen Sie 100 Milliliter entionisiertes Wasser hinzu und rühren Sie kräftig um. Es kann einige Minuten dauern, bis das Pulver vollständig mit Feuchtigkeit versorgt ist. Stellen Sie sicher, dass Sie eine homogene Mischung haben, bevor Sie diesen Schritt durchlaufen.

Wenn Sie sich dafür entscheiden, die Lebensmittelmatrix in einer einheitlichen Farbe zu färben, fügen Sie in diesem Schritt den Farbfarbstoff hinzu. Befüllen Sie eine Messspritze mit genau 10 Millilitern Lebensmittelmischung. Bei diesem Schritt ist volumetrische Präzision von größter Bedeutung, also achten Sie äußerst darauf, dass keine Luftblasen entstehen.

Nehmen Sie das 20-Milliliter-Szintillationsfläschchen mit trockenem rohem organischem Extrakt aus dem Gefrierschrank und fügen Sie ein oder zwei Tropfen Methanol hinzu. Füge nicht zu viel Methanol hinzu. Dadurch wird verhindert, dass sich die Lebensmittelmatrix festsetzt.

Mit einem Mikrospatel und minimalem Lösungsmittel den Extrakt zu einer homogenen Mischung resuspendieren. Achten Sie darauf, die Seiten des Fläschchens abzukratzen, um sicherzustellen, dass der gesamte Extrakt resuspendiert ist. Die Spritze mit 10 Millilitern Lebensmittelmatrix in das 20-Milliliter-Szintillationsfläschchen mit resuspendiertem homogenisiertem Extrakt ausstoßen.

Diese Mischung mit dem Mikrospatel verrühren, bis sie homogen ist. Laden Sie ein sehr kleines Volumen der Extraktmischung. Ein Milliliter reicht in eine Spritze.

Tauchen Sie die Spritzenspitze in eine Lösung von 0,25 molaren Calciumchlorid und stoßen Sie den Inhalt der Spritze aus, um einen langen, spaghettiartigen Strang zu bilden. Der Strang härtet in dieser Lösung aus. Entfernen Sie nach ein paar Minuten den ausgehärteten Strang und legen Sie ihn auf ein Glasschneidebrett.

Schneide den Strang mit einer Rasierklinge in vier Millimeter lange Pellets. Sammeln Sie die mit Extrakt behandelten Pellets und spülen Sie sie in Meerwasser ab. Zur Herstellung von Kontrollpellets.

Befolgen Sie das gleiche Verfahren ohne Zugabe von Gewebeextrakt. Die Zugabe von Lebensmittelfarbe kann erforderlich sein, um die Farbe der Kontroll- und behandelten Pellets anzupassen. Um eine Negativkontrolle vorzubereiten, werden die Fische mit Sicherheit das Fressen verweigern.

Geben Sie Deton- und Benzoatpulver in einer Konzentration von zwei Milligramm pro Milliliter in die Rohfuttermischung, wie von Miller und Pollock beschrieben. 2013, Fütterungstests werden mit wild gefangenen gelben Phasen-Blaukopf-RAs durchgeführt, die von Rauchfischen in Dreiergruppen in undurchsichtigen Seitenkammern des Laboraquariums gehalten werden. Ein geeignetes Utensil für die Abgabe von Lebensmittelpellets ist eine Glaspipette mit Gummikolben.

Ein Pellet gilt als akzeptiert, wenn es vom Fisch bereitwillig verzehrt wird. Ein Pellet gilt als zurückgewiesen, wenn es nach mindestens drei Versuchen eines oder mehrerer Fische, es in seine Maulhöhle aufzunehmen, nicht gefressen wird. Oder wenn man sich dem Pellet nähert und es nach einem solchen Versuch ignoriert

Unkooperative Gruppen von Fischen, die sich weigern, Kontrollpellets zu fressen, dürfen bei den Tests nicht berücksichtigt werden. Dieses Flussdiagramm zeigt, dass das Testverfahren in allen Fällen mit einem Kontrollpellet beginnt, um zu bestätigen, dass die Gruppe der Fische kooperativ ist. Bieten Sie ein behandeltes Pellet an.

Wenn der Fisch das behandelte Pellet akzeptiert, wird diese Probe als akzeptiert gewertet. Wenn die Fische das behandelte Pellet ablehnen, muss eine nachträgliche Kontrolle angeboten werden, um zu bestätigen, ob die Fische die Nahrungsaufnahme eingestellt haben. Wenn der Fisch das nachfolgende Kontrollpellet akzeptiert, wird die Probe als abgelehnt gewertet.

Jede Probe muss mit 10 unabhängigen Gruppen von Fischen durchgeführt werden. Hier ist ein Beispiellauf dieses Fütterungsassays. Zuerst wird den Fischen ein Kontrollpellet angeboten, das das Kontrollpellet akzeptiert.

Zweitens wird ein behandeltes Pellet angeboten. In diesem Fall lehnen die Fische das behandelte Pellet ab. Daher muss ein nachträgliches Kontrollpellet angeboten werden.

Die Fische akzeptieren die anschließende Kontrolle und die Probe kann als abgelehnt gewertet werden. Jede Probe muss mit 10 unabhängigen Gruppen von Fischen durchgeführt werden. Die Bedeutung von Unterschieden im Verbrauch von Kontrollpellets im Vergleich zu behandelten Pellets sollte mit einer modifizierten Version des exakten Fisher-Tests bewertet werden, wie er von Low und Pollock 2014 vorgestellt wird.

Der Test wird so modifiziert, dass die Grenzsummen für Kontrollpellets und behandelte Pellets festgelegt werden, wobei beide als Stichproben behandelt werden. Dies ergibt einen P-Wert von 0,057, wenn sieben Pellets gefressen werden. Daher gilt jeder Extrakt als abschreckend, wenn sechs oder weniger Pellets gegessen werden und schmackhaft sind.

Wenn sieben oder mehr Pellets gefressen werden. Beim Vergleich der Schmackhaftigkeit zwischen den Gruppen von Extrakten sollte die durchschnittliche Anzahl der verzehrten Pellets verwendet werden, wie in den repräsentativen Ergebnissen gezeigt wird. Hier berichten wir über die Ergebnisse dieses Bioassays für sechs Arten von karibischen Schwämmen.

Diese Daten wurden ursprünglich von Pollock et al. 1995 veröffentlicht und zeigen die Macht dieses Ansatzes zur Aufklärung von Unterschieden in den chemischen Abwehrstrategien zwischen gleichzeitig vorkommenden Taxa. Jede Kategorie auf der Y-Achse stellt Extrakte aus einer einzelnen Schwammart dar. Mehrere Individuen jeder Art wurden beprobt, extrahiert und getestet, gekennzeichnet durch die Zahl in Klammern nach dem Artnamen.

Die Ergebnisse werden als mittlere Anzahl der verzehrten Futterpellets zuzüglich des Standardfehlers für jede Art angegeben. In Assays mit rohem organischem Extrakt aus Alus, Pleth, Pheon, Kompressor und Lycin, genannt Foris, wurden fast keine Pellets gegessen. Im Gegensatz dazu werden Pellets mit Extrakt aus Cali spongy von Vais hergestellt.

Geo Osa und Michel lavis wurden im Assay ohne weiteres verzehrt. Bei den ersten drei Arten wurden weniger als sechs Pellets gefressen, so dass sie als erheblich abschreckend angesehen werden können. Im Gegensatz dazu unterschieden sich die zweiten drei Arten nicht signifikant von den Kontrollen und können als schmackhaft angesehen werden.

Die gerade gezeigten Methoden bieten einen leistungsfähigen Ansatz zur Untersuchung der anti-räuberischen chemischen Abwehr in Verbindung mit manipulativen Feldexperimenten und Erhebungen. Die Ergebnisse dieser Bioassays haben meiner Forschungsgruppe geholfen, die Faktoren zu verstehen, die die Verteilung und Häufigkeit von wirbellosen Meerestieren in karibischen Korallenriffen steuern. Wichtig ist, dass diese Methode das Bedürfnis nach ökologischer Relevanz in der chemischen Ökologie über die chemische Ökologie hinaus befriedigt.

Die Ergebnisse dieser Bioassays können in Untersuchungen in verschiedenen Forschungsbereichen einfließen, darunter Pharmakologie, Biotechnologie und Evolutionsökologie.