マウス脊髄における細胞ダイナミクスの二光子イメージング

次の実験の全体的な目標は、蛍光標識された移植された神経前駆細胞またはNPCとマウス脊髄の蛍光軸索との相互作用をリアルタイムで画像化することです。これは、NPCを移植したマウスの脊髄を慎重に取り外して5%arosに埋め込み、カバースリップに取り付けることによって達成されます。脊髄の向きは、脊髄の任意の領域で蛍光を見るように変更できます。

第2ステップでは、脊髄調製物を2光子イメージングステージに置き、生存可能なNPCをイメージングしながら、温かい酸素化RPMI培地と最大10時間超融合させます。適切なシングルエッジDIICビームスプリッターを使用して、YFP放射とGFP放射を分離します。最終的に、2光子イメージングにより、損傷した脊髄内のGFP発現NPCとYFP発現軸索との相互作用をリアルタイムで視覚化できます。

この方法は、損傷した軸索の移植されたNPC再髄鞘形成に必要な分子的および細胞的シグナル伝達の手がかりは何か、これらの再髄鞘形成イベントの動力学は何かなど、神経発生の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。背側脊髄の画像化にのみ使用できる潮間帯2光子イメージングなどの既存の方法に対するこの技術の主な利点は、この方法により、脊髄の腹側領域の奥深くに移動した移植されたNPCのイメージングが可能になることです。脊椎離断による安楽死を確認した後、マウスを70%エタノールで濡らし、鋭利な細いハサミを使用して動物の背中から毛と皮膚を取り除き、脊柱をほぼ頸椎椎板1またはC椎骨から仙骨椎板4またはS4に露出させます。

次に、10番刃のメスを使って、脊柱の左右に切開を行い、周囲の筋肉や脂肪組織から分離し、脊柱の周りや上部の余分な組織も切り取ります。これにより、椎骨の取り外しが容易になります。その後、鋸歯状の灰色の鉗子で脊椎の上部を押さえながら、脊髄に触れないように注意しながら、湾曲面を上にしてチタン製のカーブバンハサミをCワンで露出した脊柱に挿入します。

ハサミを右端までスライドさせ、小さな切り込みを1つ行います。ハサミが椎骨を切るときに、小さなカチカチという音が聞こえ、感じるはずです。コードの左端でこのカットを繰り返しますが、急ぎすぎたり、カットを大きくしすぎたり

椎骨の側面が切断されると、鉗子で単一のラミニを持ち上げることができるはずです。S 4に達するまで、各薄層に対して左右のカットを繰り返します。脊髄椎骨を保持して引き戻し続けます。

彼の背骨が移植部位まで切り取られると、移植の上の椎骨が剥がれる可能性があります。椎骨がS4に縮小されたら、移植部位がどこにあるかを視覚化するために椎骨を横たえ、移植部位まで約20ミリメートルの吻側と寄り添いを切断します。次に、11番の刃が付いたメスを使用して、脊髄の腹側の左右の吻側の端から慎重に神経節を切断します。

次に、脊髄が下を向くように動物を反転させて保持し、閉じた鋸歯状の墓鉗子を使用して、コドルの端から脊髄を慎重に剥がします。次に、脊髄を傷つけずに、残りの神経節のいずれかを慎重に切断して、脊髄が無傷の1つのピースで持ち上げられるようにし、コードを氷上の媒体に置いて、脊髄をイメージングする準備をします。神経組織を腹側を上にしてパラメータのシートに移します。

次に、調製したばかりの37°C、5%のアグロ溶液を約5ミリリットルのコードにピペットで移し、室温で固めます。約5分後、22ミリメートル四方のカバースリップにティッシュ接着剤を薄く塗り、埋め込まれた脊髄腹側を下にして新しいパーフィルに反転させます。露出した背側にカバースリップを接着し、準備全体を新しい媒体に浸して接着剤を固めます。.

次に、かみそりの刃を使用して、余分な固化したアガローズを取り除きます。次に、チューブポンプに接続されたチューブをメディアボトルに挿入し、水浴に入れて摂氏37度に超融合させます。顕微鏡ステージ上で毎分3ミリリットルのカスタムビルドイメージングウェルを通じて、かなり温められたメディア。

次に、腹側を上に向けて脊髄製剤をウェルに入れます。2光子顕微鏡で腹側脊髄を画像化するには、900ナノメートルに調整された超チタンサファイアレーザーを使用し、試料のレーザー出力を5%未満に減衰させて光毒性を最小限に抑えます。次に、接眼レンズと明視野光源を使用して、浸漬対物レンズを脊髄の腹側端に焦点を合わせます。

基準点を設定するには、周囲光源がオフになっていることを確認してください。次に、レーザーシャッターを開いて、可能な場合は2つのフォトニックサイテーションを切り替えます。関心のある領域を組織で検索する場合は、解像度を低く設定し、デジタルズームなしでボリュームを大きく設定し、最終画像を取得する場合よりもスキャンレートを高くします。

細胞を見つけるには、組織の端、最初に移植部位で明視野照明下でサンプルに焦点を合わせ、次に蛍光に切り替えるのが最善です。その後、低解像度の大きなXフィールドとYフィールドを使用して、焦点が組織の奥深くに移動するときに、広い領域をすばやく表示できるようにすることができます。脊髄の腹側縁付近のEYFP軸索を観察します。

ここで青色で観察されたコラーゲンからの2番目の高調波信号は、脊髄組織の端で最も明るくなります。次に、適切な画像キャプチャソフトウェアを使用して、最終的な高解像度画像を2.5ミクロン刻みでシーケンシャル焦点面に取得し、Zスタックをコンパイルします。この表現では、GFP NPCは青色で観察され、損傷したYFP軸索は黄色の擬似着色として観察され、後で編集ソフトウェアを使用して実行でき、その後、適切なインターレイオフセットで双方向スキャンを実行して、脊髄内の移動するオブジェクトの迅速な定量化を確保し、脊髄内の細胞速度を決定するための理想的な取得フレームレートが毎秒約1.7フレームに設定されていることを確認します。

最後に、適切なソフトウェアを使用して画像ファイルのクロップ、スムース、疑似カラーを分析し、自動化されたプロセスを使用して連続した画像ボリュームをくまなく調べ、最終的なタイムラプスビデオを作成します。この外植脊髄イメージングプロトコルは、脊髄内の任意の蛍光を視覚化するために使用できますが、これらの画像は、腹側脊髄内の単一のZスタック内のEYFP軸索と代表的なEGFP神経前駆細胞の相互作用を示しています。その後、連続したZacksの取得をまとめて、無傷の組織内のリアルタイムの細胞ダイナミクスを分析するためのタイムラプスビデオを作成できます。

実際、520ナノメートルのシングルエッジダイクロイックビームスプリッターと560ナノメートルのシングルエッジダイクロイックビームスプリッターを使用すると、EGFP信号とEYFP信号を分離でき、ここで示すようにイメージングソフトウェアを使用して緑と黄色の個々のチャネルを疑似着色することができます、この手順を試みながら、過度のストレッチなしでマウスから脊髄を適切に除去することを覚えておくことが重要です。 神経組織の圧迫、または偶発的な切断。この手順では、蛍光標識された細胞または軸索の任意の組み合わせをリアルタイムで画像化して、さまざまな薬物治療または条件下での移動または再髄鞘形成の動態など、追加の質問に答えることができます。