Name: Dik Görüntüleme Drosophila Yumurta Odaları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Öğrenin dik görüntüleme yöntemiyle Drosophila melanogaster yumurta odalarının kutuplarını yüksek çözünürlüklü incelemeyi. Bu teknik, folliküler epitel hücre düzenini ortaya çıkararak gelişim biyolojisi araştırmalarına yeni perspektif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sinek topluluğu üyelerinin, özellikle Dr. Denise Montell, Dr. Lynn Cooley ve Dr. Pernille Rorth'un reaktifler için yardımını takdir ediyoruz. Flybase, Bloomington Drosophila Stok Merkezi ve Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası'na sırasıyla bilgi ve sinek stokları ve antikorları sağladıkları için teşekkür ederiz. LM, Eğitim Bakanlığı Hibesi, Ulusal İhtiyaç Alanlarında Lisansüstü Yardım (GAANN) eğitim bursu (P200A120017) ve Öğrenci Gelişimini En Üst Düzeye Çıkarma Hibesi için bir NIGMS Girişimi (2 R25-GM55036) tarafından desteklenmektedir. Mikroskopi çalışmasının bir kısmı NSF MRI hibesi DBI-0722569 ve Keith R. Porter Çekirdek Görüntüleme Tesisi tarafından desteklenmiştir. Araştırma kısmen, her ikisi de MSG'ye verilen bir NSF KARİYER Ödülü (1054422) ve March of Dimes'tan bir Basil O'Connor Başlangıç Akademik Ödülü ile desteklendi.

Ovarioles 1. Diseksiyon <ol><li> Ilave aktif kuru maya ile taze sinek gıda flakon yaklaşık onbeş 2-4 gün eski erkek sineklerin ve birkaç erkek aktarın. Şişelerde için fiş olarak pamuk kullanın, ve yüksek nem tutmak için pamuk su birkaç damla ekleyin. </li><li> 14-16 saat için 25 ° C inkübatör yerleştirin flakon aşaması 8-10 yumurta odaları sayısını en üst düzeye çıkarmak için. Not: Kuluçka süresi sıcaklığa ve istenilen aşamasına bağlı olarak değişmektedir. </li><li> Bir sonraki gün için gerektiği gibi diseksiyon medya hazırlayın, 0.1M KPO 4 ve NP40 çözümleri (Malzeme). </li><li> CO 2 kullanarak sinek anestezisi ve bir diseksiyon mikroskop altında yerleştirin. Pipetleyin cam depresyon slayt her boşluğuna diseksiyon medya birkaç damla. </li><li> Bir kadın sinek aşağı kanatları ile masa üstü ve yönlendirmek için yaklaşık 30 ° açıyla her el forseps tutun. Senin baskın olmayan el ile, a onu kavrayarak, forseps kullanarak kadın pick upToraks yakın karın, bir nterior ve depresyon slayt (Şekil 1A içerlek) diseksiyon ortama onu daldırın. </li><li> Forseps diğer çift, karın ventral posterior Exoskeleton kavramak ve delip. Posterior sonunda yumurtalıkları tut, sonra karın çekip çıkarın ve depresyon slayt diğer tarafında taze ortama yerleştirin. (Şekil 1A ek). Gut ayrı çekerek kaçının. Karkas atın. </li><li> Tüm yumurtalıkların disseke kadar diğer kadın sinekler tekrarlayın. Erkek atın. </li><li> Forseps bir çift, (büyük yumurta odaları yakınında) arka ucunda bir yumurtalık tutun ve diğer elinizle en ön yumurta odaları (germarium) birini çimdik forseps bir çift kullanın. (Şekil 1A). </li><li> Yavaş ve istikrarlı, yumurtalık kılıfın dışında bir ovaryol zinciri çekin. İstenen tüm yumurta odaları r kadar tek tek ovarioles teşrih devamemoved. </li><li> Tekrar tüm disseke yumurtalıklar için 1,7-1,8 adımları. </li><li> Tamamlandığında, plastik transfer pipet kullanarak 0.6ml tüp ovarioles aktarın. </li><li> Ovarioles, tüpün dibine çöker sonra sabitleme ve boyama adımlara devam edelim. </li></ol> Ovarioles 2. Immunofluorescent (IF) Boyama <ol><li> Dikkatle bir pipet ile ovarioles gelen diseksiyon ortamı çıkarın. Herhangi bir ovarioles veya yumurta odaları kaldırmak için emin olun. Ovarioles ve diseksiyon medya yaklaşık 50 ul bırakın. </li><li> Bir tüp içinde 0.1 M KPO 4 Tampon 150 ul% 16 paraformaldehit 50 ul ekle ve bunları çözmek için yumurta odalarına solüsyonunu ilave edin. 10 dakika süre ile sallanan kuluçkalayın. DİKKAT: paraformaldehit toksiktir. </li><li> Fiksatif çıkarın ve 0.5 ml NP40 yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. </li><li> 15 dakika oda sıcaklığında her biri için iki kez yıkanır. </li><li> Sonraki adımlar için standart IF protokol 15 bakın. <ol><li> Kısaca, tespit sonrasında, eklemekUygun seyreltmede primer antikorlar ile 4 ° C&#39;de O / N inkübe edin. (: 200 seyreltmeler 1) sonra ikincil antikorlar ekleyin, NP-40 birkaç kez yıkayın. </li><li> NP40 birkaç kez yıkayın, sonra DAPI (1: 1000) ekleyin, 10 dakika boyunca, daha sonra yıkama tekrarlayın. Protokol tamsa sonra, yumurta odalarına PBS içinde% 50 gliserol, 200 ul ve 2 saat boyunca oda sıcaklığında bekletin. </li><li> , Çözüm çıkarın PBS içinde% 70 gliserol ile değiştirin, ve folyo ile kaplayın. Montaj için hazır olana kadar 4 ᵒC de örnek yerleştirin. Bu arada, adım 3 ile devam edin. </li></ol></li></ol> Gliserin Jelly Slaytlar 3. Ön Hazırlıklar <ol><li> Jöle gliserin, bir spatula ile en az 4 ml ölçün ve yarım işareti cam hücre kültürü tüp doldurun. 30 dakika boyunca 55 ° C&#39;de bir su banyosu içinde gliserin jöle eritin. </li><li> İki mikroskop slaytlar üzerine stok çözeltisinden gliserol küçük bir damla, yaklaşık 300 ul, dökün. Bir dokuyu kullanarak, ince la gliserol yayıldıyer&#39;de slaytlar her karşısında. Bu temel sağlar ve adım 5.6 de gliserin jöle kolay çıkarılması için izin verir. </li><li> Filtrelenmiş 1.000 ul pipet kapalı ucu kesin. Kullanım kesme pipet yavaş yavaş her mikroskop lamı sıcak gliserin jöle 1000-1500 ul aktarmak için. Kabarcıklarını önlemek için özen gösterin. </li><li> Gliserin jöle slaytlar ayarlamak için oda sıcaklığında 5 dakika bekletin. </li><li> 60 mm x 15 mm petri her gliserin jöle slayt yerleştirin ve plastik wrap ile kaplayın. 4 ° CO / N Place. İsteğe bağlı olarak, mağaza 4 ° C&#39;de en fazla 5 gün jöle slaytlar gliserin. </li></ol> 4. Yumurta Chambers Montaj <ol><li> Adım 2.5, bir gliserin jöle slayt genelinde% 70 gliserol yumurta odaları pipet birkaç 3 ul damla örnekler kullanma. Tüm yumurta odaları bu slaytta kadar pipetlenmesi 3 ul damla devam edin. Her damla, en az on yumurta odaları içerdiğinden emin olun. Bu arada, 55 ° C su banyosu içinde gliserin jöle kültür tüpü ısı. </li><li> Bir diseksiyon mikroskop altında yumurta odaları ile gliserin jöle slayt yerleştirin. Yumurta bölmelerin tek bir damla görüş alanı (Şekil 1B) olacak şekilde büyütme ayarlayın. </li><li> İstenilen sahne yumurta odasını pick up, bir kaşık gibi 30 iğne kullanma. Ne zaman bir bıçak gibi iğne kullanılarak bir ovaryol zinciri gerekli, ayrı istenen yumurta odaları. </li><li> Görüntüleme engel olabilir enkaz önlemek için, sol (Şekil 1E -1) bakan anterior, ikinci gliserin jöle slayt yumurta odasına aktarın. En az yedi yumurta oda, bir sütun (Şekil 1C) dizilmiş kalmayana kadar yineleyin. </li><li> İstenen tüm yumurta odaları ikinci gliserin jöle slayt transfer kadar yedi yeni sütunlar oluşturur. </li><li> Doku ve büküm küçük bir parça koparın. Hafifçe her birine dokunarak yumurta odalarından fazla PBS-Gliserol emmek için bunu kullanın. Yumurta odalarına kaldırmak değil dikkat edin. </li><li> Ayırmakfiltrelenmiş 200 ul pipet ucu. Yumurta odalarının tüm sütunları kapsayacak şekilde jöle gliserin 150 ul aktarmak için bunu kullanın. NOT: sütunları karşılamak için gerekli gliserin jöle miktarı yumurta odası aşamaları ve sütun sayısına bağlıdır. Miktarı ayarlanabilir. </li><li> Gliserin jöle üst tabakası tamamen (Şekil 1D) katılaşmış kadar monte yumurta odaları oda sıcaklığında 5 dakika bekletin. </li><li> Place 60 mm x 15 mm petri monte yumurta odaları slayt ve plastik wrap ile kaplayın. 4 ° CO / N Mağaza (photobleaching hakkında endişe varsa karanlıkta yer) gliserin jöle katmanları bir araya katılaşmaya izin. </li></ol> Görüntüleme Yumurta Odaları 5. hazırlanması <ol><li> Bir diseksiyon mikroskobu altında monte yumurta odaları slayt yerleştirin. Yumurta bölmelerin sadece bir sütun görüş alanında olacak şekilde büyütme ayarlayın. </li><li> 45 ° açı minyatür neşter kullanarak, bir straig kesti(yumurta odaları arka tarafına yakın) yumurta odaları ilk sütunun sağ tarafı boyunca ht hattı. (Şekil 1D-e) </li><li> Sonraki, sütundaki son yumurta odasının üstündeki ilk yumurta odasının üstünde ve altında kesti. Bu noktada, yumurta bölmelerin kolon üç tarafı kesilmelidir. </li><li> Yumurta odalarına (Şekil 1E -3) ön tarafına mümkün olduğunca yakın bir microknife, sütunun sol tarafındaki dilim, kullanma. </li><li> Kesim sütun üzerinde soğuk 1X PBT 100 ul pipet. </li><li> Slaytta kalanı bırakarak, yumurta odaları ve atın kesme sütunu üç tarafı etrafında aşırı gliserin jöle kaldırmak için bir yuvarlak kenarlı spatula kullanın. </li><li> Yumurta odalarının ön tarafında yapılan kesim spatula yerleştirin ve birincil gliserin jöle bloğundan sütun ayrı. </li><li> Örnekleri için ya ters (5.8.1) veya dik (5.8.2) mikroskopi hazırlayın. <ol><li> Ters Mikroskop için: Devir tYumurta odalarının ön tarafı aşağı bakacak şekilde bir lamel yumurta odalarından o sütun. Gliserin jöle tüm sütunlar kaldırıldı ve monte edilene kadar tekrarlayın 5,2-5,8 adımları. Kurumasını önlemek için yumurta odaların her blok üzerine,% 50 PBS-Gliserin birkaç damla ekleyin. Doğrudan lamel Görüntü yumurta odaları. </li><li> Dik Mikroskop için: ön tarafı yukarı bakacak şekilde bir mikroskop lamı yumurta odalarının sütun aktarın. Gliserin jöle tüm sütunlar kaldırıldı ve mikroskop slaytlar üzerine monte edilene kadar tekrarlayın 5,2-5,9 adımları. # 1 ½ lamel ile yumurta odaları ve kapak blok, her blok üzerine% 50 PBS-Gliserin birkaç damla ekleyin. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hudson, A. M., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying oogenesis.</a> Methods. 68 (1), 207-217 (2014).</li>
<li>Bastock, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila oogenesis.</a> Curr Biol. 18 (23), R1082-R1087 (2008).</li>
<li>Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+follicle+cells%3A+morphogenesis+in+an+eggshell%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell.</a> Semin Cell Dev Biol. 19 (3), 271-282 (2008).</li>
<li>Bilder, D., Haigo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+morphogenetic+repertoire%3A+perspectives+from+the+Drosophila+egg%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Expanding the morphogenetic repertoire: perspectives from the Drosophila egg.</a> Dev Cell. 22 (1), 12-23 (2012).</li>
<li>Montell, D. J., Yoon, W. H., Starz-Gaiano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+choreography%3A+mechanisms+orchestrating+the+collective+movement+of+border+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Group choreography: mechanisms orchestrating the collective movement of border cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (10), 631-645 (2012).</li>
<li>Spradling, A. C., Bate, M., Marinez-Arias, A. Developmental genetics of oogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpradling%2C+AC+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).</li>
<li>Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Border-cell+migration%3A+the+race+is+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Border-cell migration: the race is on.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 13-24 (2003).</li>
<li>Silver, D., Geisbrecht, E., Montell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+JAK%2FSTAT+signaling+throughout+border+cell+migration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Requirement for JAK/STAT signaling throughout border cell migration in Drosophila.</a> Development. 132 (15), 3483-3492 (2005).</li>
<li>Ghiglione, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+cytokine+receptor+Domeless+controls+border+cell+migration+and+epithelial+polarization+during+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Drosophila cytokine receptor Domeless controls border cell migration and epithelial polarization during oogenesis.</a> Development. 129 (23), 5437-5447 (2002).</li>
<li>Denef, N., Schüpbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning%3A+JAK-STAT+signalling+in+the+Drosophila+follicular+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Patterning: JAK-STAT signalling in the Drosophila follicular epithelium.</a> Curr Biol. 13 (10), R388-R390 (2003).</li>
<li>Beccari, S., Teixeira, L., Rørth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAK%2FSTAT+pathway+is+required+for+border+cell+migration+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The JAK/STAT pathway is required for border cell migration during Drosophila oogenesis.</a> Mech Dev. 111 (1-2), 115-123 (2002).</li>
<li>Montell, D., Rorth, P., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((slow+border+cells%2C+a+locus+required+for+a+developmentally+regulated+cell+migration+during+oogenesis%2C+encodes+Drosophila+C%2FEBP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">slow border cells, a locus required for a developmentally regulated cell migration during oogenesis, encodes Drosophila C/EBP.</a> Cell. 71 (1), 51-62 (1992).</li>
<li>Xi, R., McGregor, J., Harrison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gradient+of+JAK+pathway+activity+patterns+the+anterior-posterior+axis+of+the+follicular+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A gradient of JAK pathway activity patterns the anterior-posterior axis of the follicular epithelium.</a> Dev Cell. 4 (2), 167-177 (2003).</li>
<li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+wave+of+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A new wave of cellular imaging.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).</li>
<li>McDonald, J., Pinheiro, E., Kadlec, L., Schupbach, T., Montell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+EGFR+ligands+participate+in+guiding+migrating+border+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple EGFR ligands participate in guiding migrating border cells.</a> Dev Biol. 296 (1), 94-103 (2006).</li>
<li>Van de Bor, V., Zimniak, G., Cérézo, D., Schaub, S., Noselli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+localisation+of+cytokine+mRNA+is+essential+for+JAK%2FSTAT+activation+during+cell+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Asymmetric localisation of cytokine mRNA is essential for JAK/STAT activation during cell invasiveness.</a> Development. 138 (7), 1383-1393 (2011).</li>
<li>Hayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glypicans+regulate+JAK%2FSTAT+signaling+and+distribution+of+the+Unpaired+morphogen%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Glypicans regulate JAK/STAT signaling and distribution of the Unpaired morphogen.</a> Development. 139 (22), 4162-4171 (2012).</li>
<li>Airoldi, S. J., McLean, P. F., Shimada, Y., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+protein+movement+in+syncytial+Drosophila+follicle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Intercellular protein movement in syncytial Drosophila follicle cells.</a> J Cell Sci. 124 (Pt 23), 4077-4086 (2011).</li>
<li>Rørth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+gain-of-function+genetics+in+Drosophila%29%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Systematic gain-of-function genetics in Drosophila).</a> Development. 125 (6), 1049-1057 (1998).</li>
<li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies%3A+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).</li>
<li>Shimada, Y., Burn, K. M., Niwa, R., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+response+of+protein+localization+and+microtubule+organization+to+nutrient+stress+during+Drosophila+early+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversible response of protein localization and microtubule organization to nutrient stress during Drosophila early oogenesis.</a> Dev Biol. 355 (2), 250-262 (2011).</li>
<li>Quiñones-Coello, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+strategies+for+protein+trapping+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Exploring strategies for protein trapping in Drosophila.</a> Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).</li>
<li>Buszczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carnegie+protein+trap+library%3A+a+versatile+tool+for+Drosophila+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies.</a> Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).</li>
<li>Belu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upright+imaging+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Upright imaging of Drosophila embryos.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li>
<li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-on+imaging%3A+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Dev Dyn. 237 (11), 3252-3259 (2008).</li>
</ol>

Yazarların birbiriyle rekabet eden hiçbir mali çıkarı yoktur.

Burada bir son perspektif yumurta odaları gelişmekte, montaj için bir yöntem tarif ve görüntü küçük. Görüntüleme yumurta odaları için ortak teknikler yanal görünümler için optimize edilmiş ve floresan antikorlar ile boyanmış zaman öncelikle iç-dış folikül hücreleri hassas görselleştirme izin vardır. Birden fazla odak düzlemleri görüntüleme Z-yığınlarının veya 3-D rekonstrüksiyonlar yardımcıları kullanımı, ama yine de eliptik yumurta odaları (Şekil 2B) kutuplarının alt hücresel çözünürlük için yetersiz. ...

Drosophila melanogaster Çalışma olayların geniş bir genetik yönetmelik seyircilerden büyük anlayışlar sağladı. Oogenez doku desen, hücre polarite değişiklikleri, hücre döngüsü anahtarlama ve translasyonel yönetmelik 1,2,3,4 dahil olmak üzere birçok farklı gelişim süreçleri, araştırmak için bir uysal bir yol sağlar, çünkü özellikle, yumurta gelişimi üzerine kapsamlı bir araştırma olmuştur. Oogenez sırasında önemli bir morfojenik olay (5 gözden) sınır hücreleri denilen hücreler bir dizi özellikleri, motilite edinimi ve göç. Hücre göçü beri hayvan morfojenezinin önemli bir özelliğidir ve bu sürecin genetik düzenleme iyi korunduğu için, sinekler belirlenen mekanizmaları diğer bağlamlarda önemli olması muhtemeldir. Böylece, biz sınır hücre migrasyonu moleküler kontrolü araştırıyor. Bizim çalışmalar için, biz yumurta geliştirme ön direkleri gözlemlemek için yeni bir yöntem geliştirdik,Sınır hücreleri ortaya yerlerde, detaylı olarak nasıl geliştiğini incelemek için. Yumurtalık içinde, çeşitli gelişim aşamalarında yumurta odaları ince kılıf (Şekil 1A) &#39;de muhafaza edilir ovarioles adı zincirleri boyunca mevcuttur. Her yumurta bir yumurta odası oluşturmak için devam edecektir. Oogenesiz sırasında, çok sayıda, farklı hücre tipleri, bir koordine bir şekilde geliştirilmesi gerekmektedir. D. melanogaster yumurta bölmesi tek katmanlı foliküler epitel 6 ile çevrili bir oosit, aşağıdakileri içeren 16 germ hat hücrelerine oluşur. Kutup hücreleri denilen özelleşmiş hücrelerin az sayıda, epitel anterior ve posterior kutuplarda ortaya çıkar. 6-8 sınır hücreleri kutup hücreleri 5,7 ile uyarılan yumurta odasının ön epiteli, köken. Orta-oogenez (evre 9), sınır hücreleri komşularından ayırmak ve yumurta odasının 5,7 olan posterior oosit ulaşmak için hemşire hücreleri arasındaki göç. Bu hareket yerine getirmesi gerekirSınır hücreleri bu kolektif hücre göçü bir tür yapma, olmayan iki hareketli kutup hücreleri çevreleyen bir kümede kalırken. Sınır hücre kümesinin Başarılı göç döllenme için gerekli olan yumurta kabuğu micropyle, düzgün gelişimini sağlar. ön kutup hücreleri sinyal iletim dizinini aktive ederek hücre sınır kaderi talimat. Polar hücreler oosit gelişimi 8,9 aşamasında 8 sırasında folikül hücreleri komşu, bir transmembran reseptörü, Kubbesiz (DOME) bağlanan bir sitokin, eşleşmemiş (UPD), salgılarlar. UPD bağlanması Janus tirozin kinaz (JAK) transkripsiyon (STAT) 8,10,11 arasında sinyal ileticisi ve Activator fosforile olur. STAT sonra transkripsiyonu aktive etmek çekirdeğine geçer. Yavaş Sınır Hücreler (SLBO) STAT doğrudan bir transkripsiyonel hedef ve sınır hücre göçü 12 için gerekli olan bir transkripsiyon faktörüdür. Yumurta odaları Yanal manzarası t gösterirşapka STAT etkinliği ön epiteli 8,11,13 boyunca bir degrade düzenlenmiştir. Kutup hücrelere yakın folikül hücreler bu nedenle sınır hücreleri haline ve komşu germ-line doku istila, aktif STAT en yüksek seviyeleri var. Sınır hücreleri içinde belirtilen ve epitel ayırmak nasıl anlamak için, biz doku nasıl düzenlendiğini gözlemlemek gerekir. Biz bir ön-perspektif yumurta odaları görmek, biz kutup hücreleri çevreleyen folikül hücreleri STAT aktivitesinin radyal simetri beklenebilir. Bir son bakış da daha doğru önce ve farklı odak düzlemlerinde hücreleri karşılaştırma daha Ayırma sırasında zar proteinleri ve hücre-hücre arayüzleri farklılıklar gösterir. Yumurta odaları dikdörtgen ve sap hücreleri birbirine bağlı olduğundan, onlar zor ön mimarisi gözlemlemek için yapım, yanal slaytlar üzerine yerleşmek. Böylece, yumurta odasının kutuplarda hücreler hakkında çok bilgi vardırLateral manzaralı olayla edilmiştir. Bazı bilgiler Photobleaching optik bölümlerde, ışık saçılması, algoritmik 3-D rekonstrüksiyon ve Z-ekseninde çözünürlük yoksul limitler aracılığıyla elde edilebilmesine rağmen süper çözünürlüklü mikroskopi 14 gibi pahalı tekniklerin yokluğunda bu bilgilerin daha az detaylı ve güvenilir hale . Bölüm-tabanlı görüntüleme diğer şekillerde (örneğin, elektron mikroskobu veya mikrotom kesit) eserler için olasılığını artırarak, dehidrasyon dahil dokuların, geniş manipülasyon gerektirir. Böylece, biz görüntü D. yeni bir yöntem geliştirdi dik iken melanogaster yumurta odaları. Bu yöntem zaten (inceleme altında Temsilcisi sonuçları ve Manning ve arkadaşları, bakınız) hareketli hücreler kaderde nasıl durulaştırmada yararlı kanıtlanmış ve daha geniş değerli oogenezisin diğer yönleri çalışmalarda olması muhtemeldir.

<table><tbody><tr><td>0.1 M Potasyum fosfat Tamponu (KPO4 Tamponu)</td><td></td><td></td> <td>3.1 g NaH 2PO4 ekleyin ve boğa; H2O ve 10.9 g Na2HPO4 (susuz) 1 L'lik bir hacim elde etmek için damıtılmış H2O'ya. Nihai çözeltinin pH'ı 7.4 olacaktır. Bu tampon 4 ° C'de 1 aya kadar saklanabilir.</td></tr><tr><td>% 16 Paraformaldehit sulu çözelti, EM sınıfı</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>GFP floresansını korumak için</td><td>15710</td> metanol içermez</tr><tr><td>30G x 1/2 inç iğne ve nbsp;</td><td>VWR</td><td>BD305106</td><td>Düzenli eğim</td></tr><tr><td>Aktif Kuru Maya</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-103</td><td>Dişi sinekleri şişmanlatmak için</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>PAA-hücre kültürü şirketi</td><td>A15-701</td><td>NP40 Yıkama Tamponunda Kullanılan</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11295-10</td><td>Dumostar alaşımı, biyoloji ucu; Ovariole diseksiyonu</td></tr> <tr><td>için keskin uçlar gereklidirDAPI (4&asal;,6-Diamidino-2-fenilindol dihidroklorür)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>5 mg/ml stok çözeltisi&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td>Ek diseksiyon ortamına eklendi (%10)&nbsp;</td></tr><tr><td>Cam kültür tüpü</td><td>VWR</td><td>47729-576</td><td>14 ml</td></tr><tr><td>Cam Çöküntü Slaytları</td><td>VWR</td><td>470019-020</td><td>1,2 mm Kalınlığında, Çift Boşluklu</td></tr><tr><td>Gliserin Jölesi&nbsp;</td><td>Elektron Mikroskopi Bilimleri</td><td>17998-10</td><td>Montaj ortamı</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>IBI Bilimsel</td><td>IB15760</td><td>PBS'de %70</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-500ML</td> <td>(Nonidet P-40 için değiştirilebilir)&nbsp; NP40 Yıkama Tamponunda kullanılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Leica Floresan Stereoskop&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica SP5 Konfokal Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>40x/0.55NA kuru objektif&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikro spatula&nbsp;</td><td>VWR</td><td>82027-518</td><td>Paslanmaz çelik</td></tr><tr><td>Mikroskop Slaytı</td><td>VWR</td><td>16004-368</td><td>75x25x1 mm</td></tr><tr><td>NP40 Yıkama Tamponu</td><td></td><td></td><td>50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, %0.5 Ipegal, 1 mg/ml BSA ve %0.02 sodyum azid</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin-Glutamin</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td>Ek diseksiyon ortamına eklendi (0.6X)</td></tr><tr><td>Petridish- Polisterin, steril</td><td>VWR</td><td>82050-548</td><td>60 W x 15 H mm</td></tr><tr><td>Fosfat Tampon Tuzlu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td><td>10 paket Toz</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat dibazik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786-500G</td><td>0.1 M KPO4 Tamponda kullanılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791-500G</td><td>0.1 M KPO4 Tamponda Kullanılır&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Schneider' s Böcek Orta</td><td>Ömürlü Teknolojiler</td><td> 11720018</td><td>L-glutamin ve sodyum bikarbonat ile</td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>Floresan antikor boyamada kullanılır</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014-500G</td><td>NP40 Yıkama Tamponunda Kullanılır</td></tr><tr><td>TRIS-HCl</td><td>IBI Bilimsel</td><td>IB70144</td><td>1 M TRIS-HCl, pH 7.4</td></tr><tr><td>Uçuculuk 3D Görüntü Analiz Yazılımı</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Konfokal Z-yığınlarını işlemek için</td></tr></tbody></table>

dik görüntüleme<em&gt; drosophila</em&gt; yumurta odaları

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenezi, yumurtalığın mimaride nispeten basit olması, iyi karakterize edilmesi ve genetik analize uygun olması nedeniyle çeşitli gelişimsel süreçleri incelemek için ideal bir bağlam sağlar. Her yumurta odası, somatik folikül hücrelerinin tek bir epitel tabakası ile çevrili germ hattı hücrelerinden oluşur. Folikül hücrelerinin alt kümeleri, birkaç farklı hücre tipi haline gelmek için belirli aşamalarda farklılaşmaya uğrar. Standart teknikler öncelikle yumurta odalarının yanal bir görünümüne ve dolayısıyla folikül hücre organizasyonu ve kimliğinin sınırlı bir görünümüne izin verir. Dik görüntüleme protokolü, standart bir konfokal mikroskop ile yumurta odalarının yeni, dikey bir görüntüsünü sağlayan bir montaj tekniğini tanımlar. Numuneler önce bir cam mikroskop lamı üzerinde yanal (yatay) konumda iki gliserin jöle tabakası arasına monte edilir. Kaplanmış yumurta odalarına sahip jöle daha sonra bloklar halinde kesilir, bir lamel üzerine aktarılır ve yumurta odalarını dik konuma getirmek için çevrilir. Monte edilmiş yumurta odaları, dik veya ters konfokal mikroskopta görüntülenebilir. Bu teknik, folikül hücresi spesifikasyonu, organizasyonu, moleküler belirteçler ve yumurta gelişiminin yeni ayrıntılarla ve yeni bir bakış açısıyla incelenmesini sağlar.

dik görüntüleme yöntemi bize aşamada 8. anterior foliküler epitel hücrelerinin doğrudan organizasyonu görmek için izin bir folikül hücre kaderi için genel işaretleyici, Gözler Yok (EYA) proteini, yanı sıra nükleer DNA işaretleyici DAPI, hatta ifade gösterdi hücrelerin bu alan boyunca ve tüm hücreler içindeki boyama yoğunlukları (Şekil 2B &quot;) ile görülebilir gösterdi. Sitokin UPD yanıt olarak ayarlanır proteinler Bununla birlikte, değişken şekilleri ve sentezleme seviyeleri göstermiştir. Polar hücrel...

Bu protokolde açıklanan dik görüntüleme yöntemi, gelişmekte olan bir Drosophila melanogaster yumurtasının kutuplarının ayrıntılı olarak görüntülenmesine olanak sağlar. Bu uçtan bakış, foliküler epitelde çoklu hücre tiplerinin düzenlemelerine ve morfolojilerine yeni bir bakış açısı sağlar.

Dik Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurta Odaları

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Bu prosedürün genel amacı, drosophila yumurta odacıklarının kutuplarının yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlamaktır. Bu işlem, öncelikle ovaryumların diseke edilmesi ve floresan antikorlarla boyanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise ilgili yumurta odacıklarının belirlenmesi ve ayrılmasıdır.Sıradaki seçilen örnekler yönlendirilir ve hizalanır, ardından gliserinli jöle bloklarına gömülür. Son adım, yumurta odacıklarının uzun ekseninin dikey olacak şekilde yerleştirilmesi için blokların kesilmesi ve döndürülmesidir. Son olarak, yumurta odacığının kutuplarındaki hücresel ve hücre altı organizasyonu ortaya çıkarmak için konfokal mikroskopi kullanılır.Sınır hücre düzenlemeleri gibi epitel dokular için, optik kesitleme ve algoritmik 3B rekonstrüksiyon yoluyla örnekleri görüntüleme düzlemine dik olarak görüntülemeye yönelik mevcut yöntemler, fotoblançinge ve ışık saçılmasına neden olabilir ve daha düşük çözünürlük sağlayarak daha az doğru görüntüler üretir. Bu tekniğin temel avantajı, örnekleri yeni bir açıyla yerleştirmemize ve onları doğrudan görüntülememize olanak tanımasıdır. Folikül hücrelerinin organizasyonu hakkında bilgi sağlayan, gelişmekte olan yumurta odacıklarının ku

upright-imaging-of-drosophila-egg-chambers

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Mezoskopik floresan tomografi doku kesit floresan mikroskopi penetrasyon sınırları ötesinde faaliyet göstermektedir. Tekniği çok projeksiyon aydınlatma ve foton bir taşıma açıklamasına dayanmaktadır. Biz, in vivo morfolojilerinden tüm vücut 3B görselleştirme, GFP ifade kanat hayali diskler...

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila</em

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

VE Dik Görüntüleme Drosophila Embriyolar

Drosophila pupa Karın İmmünohistokimya

Bireysel hazırlanması Drosophila</emCanlı Görüntüleme için> Yumurta Chambers

İmmün boyama, dokulardaki belirli hücre tiplerini ve proteinleri görselleştirmek için etkili bir tekniktir. Sonikasyonu kullanarak, burada açıklanan protokol, immünostainingden önce Drosophila melanogaster dokularını geç evre embriyolardan ve larvalardan ayırma ihtiyacını hafifletir. Formaldehitle sabitlenmiş bütün mount larvalarının immün boyaması için etkili bir metodoloji sunuyoruz.

Geç evre embriyonik ve larva soniklenmesi-kolaylaştırdı Immunoflorasan Boyama<em&gt; Drosophila</em&gt; Dokular<em&gt; Yerinde</em

Bu protokol, canlı Drosophila pupa göz nöroepitelini görüntülemek için etkili bir yöntem sunar. Bu yöntem, doku hareketini ve düzensiz topolojiyi telafi eder, birden fazla GFP etiketli bağlantı proteininin kullanılması yoluyla hücre sınırlarının görselleştirilmesini geliştirir ve kolayca monte edilebilen bir görüntüleme teçhizatı kullanır.

Canlı-görüntüleme Drosophila Pupa Göz

Bu makalede, Drosophila yumurta aktivasyonu sırasında 2+ Ca görselleştirmek için uyarlanabilir ex vivo protokolü açıklanır.

Görüntüleme Kalsiyum<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurta Aktifleştirme de

Bu protokol, meyve sineği metamorfoza uğrarken Drosophila abdominal epitelde hücre oryantasyonu ve doku büyüme dinamiklerinin görüntülenmesi ve analizi için tasarlanmıştır. Burada açıklanan metodoloji Drosophila veya diğer model organizmalarda farklı gelişimsel aşamaların, dokuların ve hücre altı yapıların incelenmesine uygulanabilir.

Pupal Evrelerinde Gelişen Drosophila Epitelinde Doku Oryantasyonu ve Büyüme Dinamiğinin Görüntülenmesi ve Analizi

Burada, Drosophila yumurtalık nişindeki germ hattı kök hücrelerinin (GSC'ler) asimetrik bölünmesinin canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Spektrozom proteini Par-1'in yeşil floresan proteini (GFP) füzyonunu her yerde ifade eden bir transgenik çizgi kullanıyoruz.

Kadın Drosophila melanogaster Germline Kök Hücre Nişlerinin Genişletilmiş Canlı Görüntülenmesi

Öğrenin dik görüntüleme yöntemiyle Drosophila melanogaster yumurta odalarının kutuplarını yüksek çözünürlüklü incelemeyi. Bu teknik, folliküler epitel hücre düzenini ortaya çıkararak gelişim biyolojisi araştırmalarına yeni perspektif sunar.

Dik Görüntüleme

Daha fazla video keşfet