Name: Transformación biolística de un fluorescente Tagged gen en el oportunista por hongos patógenos Cryptococcus neoformans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprende la transformación biolística para integrar ADN en Cryptococcus neoformans usando microportadores de oro y pistola de genes. Este método permite la integración estable mediante recombinación homóloga.

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Este trabajo fue apoyado por los premios de la Fundación Nacional de Ciencia (Premio # 0920274) y el Experimento de Carolina del Sur Estación Proyecto SC-1700340. Este papel isTechnical Contribución No. 6283 de la Estación Experimental de la Universidad de Clemson. Los autores agradecen al Dr. Lukasz Kozubowski por su útil asesoramiento en el desarrollo de este protocolo final y el Dr. Cheryl Ingram-Smith, Katie Glenn, y Grace Kisirkoi por su lectura crítica del manuscrito.

NOTA: El esquema general de este protocolo se describe en la Figura 1. 1. C. Preparación neoformans <ol><li> Para cada reacción de transformación, creciendo un 2-3 ml O / N cultura de C. neoformans en medio YPD a 30 ° C con agitación a 250 rpm. </li><li> Centrifugar el cultivo O / N durante 5 min a 900 xg a 10 ° C y descartar el sobrenadante. </li><li> Resuspender cada sedimento de células en 300 l de peptona de levadura dextrosa (YPD) medio. </li><li> El uso de perlas de vidrio, extender suavemente 300 l de la suspensión celular lavada sobre agar YPD que contiene 1 M sorbitol. </li><li> Permita que las placas se sequen a temperatura ambiente durante 3-4 horas. </li></ol> 2. Preparación de Oro microportador <ol><li> Resuspender 0,25 g de 0,6 micras cuentas de oro en 1 ml de ddH2O, centrifugar durante 1 minuto a 900 xg para sedimentar las cuentas, y eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las perlas de oro en 1 ml de etanol al 100%. &lt;/ Li&gt; <li> Distribuir las cuentas en 4 tubos, 250 l cada uno, y añadir 750 l de etanol al 100%. </li><li> Tienda alícuotas de perlas de oro a 4 ° C. </li></ol> 3. Preparación de ADN <ol><li> Preparar discos biolísticos macroportador naranja sumergiéndolas en etanol al 100% utilizando fórceps. Coloque los discos en una gran placa de Petri que contiene drierita secar (asegúrese de que el drierita no toca los discos). </li><li> Una vez seca, presione los discos macroportador en los soportes de disco de plata (previamente limpiada con etanol al 100%). </li><li> Perlas Vortex oro (preparado como en el paso 2) y alícuotas de 12 l en un 1,5 ml tubo de microcentrífuga, un tubo por la transformación. </li><li> Añadir a cada tubo con el fin de: 2 g de ADN (preferiblemente 2 l de 1 mg / l de ADN), 10 l de CaCl2 2,5 M, y base libre de 2 l 1 M espermidina. </li><li> Establecer un control negativo como en el paso 3.4, pero sin ADN. </li><li> Vortex cada tubo y se incuba a temperatura ambiente durante5 min. Golpee suavemente cada tubo de vez en cuando para volver a suspender las cuentas liquidadas durante esta incubación. </li><li> Centrifugar los tubos a 225 g durante 30 segundos para sedimentar las perlas de oro recubiertas de ADN. Retire con cuidado el sobrenadante (con la pipeta o aspiración) y deseche. </li><li> Perlas Resuspender completamente en 600 l de etanol al 100% por lentamente la pipeta hacia arriba y hacia abajo. </li><li> Haga girar los tubos a 225 g durante 30 segundos para sedimentar las perlas sin embalaje. Retirar con cuidado y desechar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las perlas de oro recubiertas de ADN en 8 l de etanol al 100% por lentamente pipeteando arriba y abajo. </li><li> Pipetear los perlas de oro recubiertas de ADN en el centro del disco biolístico en un diámetro de 1 cm y dejar secar. NOTA: Un círculo de oro seca visible en el centro del disco biolística indica que una concentración suficiente de cuentas de oro está presente. NOTA: Los discos macroportador cargados con perlas de oro recubiertas de ADN ya están listos para su uso con la pistola de genes. </li></ol> 4. OUtilizar la pistola de genes <ol><li> Encienda la bomba de vacío. </li><li> Encienda el gas helio girando el mando hacia la izquierda hasta una presión de aproximadamente 2.200 psi se alcanza en el manómetro. </li><li> Encienda la pistola de genes por voltear el interruptor rojo de la izquierda. </li><li> Asegúrese de que los caudales para el vacío y la ventilación se ajustan para el vacío llegará a 28 pulgadas de Hg dentro de 15 seg. </li><li> Asegúrese de que la distancia entre el disco de ruptura y macroportador es aproximadamente 3/8 de pulgada. </li><li> Limpie toda la cámara al lavarlo con etanol. </li><li> Sumerja los discos de ruptura en etanol al 100%. Deje secar sobre una superficie estéril (por ejemplo, placa de Petri). </li><li> Use una llave de torque para aflojar el soporte del disco de ruptura. Inserte un disco de ruptura limpia en el soporte. Atornille el soporte de disco de ruptura en su lugar y apriete con una llave de torsión girando una vez a la derecha. NOTA: Los discos de ruptura serán reemplazados después de cada sesión. </li><li> Sumerja ªpantallas de malla E en etanol al 100%. Deje secar sobre una superficie estéril (por ejemplo, placa de Petri). </li><li> Una vez seco, coloque un filtro de malla lavado de la placa de montaje de plástico blanco. Coloque el lado ADN soporte del disco macroportador abajo en la cámara de disco. Tornillo en la tapa de plata, y coloque la placa de montaje en la ranura superior. NOTA: se reemplazará la pantalla de malla después de cada sesión. </li><li> Colocar una placa de agar YPD que contiene 1 M de sorbitol en la placa inferior. </li><li> Cierre puerta de la cámara y ajustar en su lugar. </li><li> Mantenga pulsado el interruptor rojo medio hasta participar de vacío y permitir que el vacío para llegar a 28 pulgadas de Hg. Una vez que se alcanza el nivel de vacío adecuado, mueva este interruptor en la posición hacia abajo. Cuando esté listo, mantenga pulsado el interruptor rojo de la derecha para disparar. Cuando el disco de ruptura aparece, suelte inmediatamente el botón de disparo y pulse el interruptor rojo medio a la posición central para ventilar la cámara a 0 psi. </li><li> Limpie los desechos disco de ruptura y apague la pistola de genes. Luego, apague el Helium gas girando el mando hacia la derecha, y finalmente, apagar la bomba de vacío. </li></ol> 5. Las células transformadas Chapado <ol><li> Permita que las placas de transformación para sentarse a temperatura ambiente durante 4 horas para permitir que las células se recuperen. </li><li> Pipeta 700 l de YPD en el plato. Use un raspador de células para raspar suavemente las células fuera del líquido agar y pipeta en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril. Repita este paso para asegurar que todas las células se han recuperado de la placa. </li><li> Que sedimenten las células a 225 xg durante 30 seg. Retirar y desechar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el precipitado en 500 l de YPD. </li><li> Pipetear 100 l de la suspensión celular sobre el centro de las placas + antibióticos YPD y difundir el uso de cuentas de vidrio. </li><li> Deja placas invertidas a temperatura ambiente durante 3-4 días. Como aparecen colonias, parche sobre nuevo YPD + placas de antibióticos. </li></ol> 6. Aislamiento de ADN genómico para la PCR NOTA: Esta es una versión modificada utilizando el reactivos de un kit de purificación de ADN (Ver Tabla de Materiales). <ol><li> Cultivar un cultivo de 5 ml de cada uno de la C. neoformans transformantes en líquido YPD a 30 ° C con agitación a 250 rpm O / N. </li><li> Pellet 3 ml de células a 900 xg, y resuspender en 600 l de solución de lisis núcleos. </li><li> Añadir la suspensión a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con 200 l de ácido 0,5 mm se lavó perlas de vidrio. </li><li> Homogeneizar durante 45 seg en un mini BeadBeater a temperatura ambiente, el tubo de enfriar en hielo, y repetir. </li><li> Permita que la muestra se asiente en hielo durante 2 min y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml. Añadir 200 l de solución de precipitación de proteína a cada tubo, (100 l por cada 600 l de sobrenadante recuperado) y agitar vigorosamente durante 20 seg. </li><li> Dejar que las muestras se asienten en hielo durante 5 min, y se centrifuga a 11.000 xg durante 3 min. </li><li> Transferir el sobrenadante a un tubo de 1,5 ml limpio que contiene 300 l de RT isopropanol. Mezclar suavemente por inversión. </li><li>Centrifugar las muestras a 11.000 xg durante 2 minutos, retire con cuidado el sobrenadante, y drenan los tubos sobre toallas de papel. </li><li> Añadir 300 l de RT 70% de etanol a cada tubo, y invertir suavemente para lavar el pellet. </li><li> Centrifugar las muestras a 11.000 xg durante 2 minutos, y retirar con cuidado todo el etanol. </li><li> Vacíe el tubo sobre toallas de papel limpias, y permitir que el precipitado se seque al aire durante 10-15 min. </li><li> Añadir 50 l de solución de rehidratación de ADN y 1,5 l de solución de RNasa a cada sedimento y vórtice. </li><li> Centrifugar las muestras durante 5 segundos para eliminar todo el líquido de la tapa. </li><li> Incubar las muestras a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Rehidratar el ADN mediante la incubación de las muestras a 65 ° C durante 1 hr. </li><li> Cuantificar ADN espectrofotométricamente midiendo la absorbancia a 260 nm (260 A una lectura de 1,0 es equivalente a ~ 50 g / ADN de doble hebra ml), y usar hasta 200 ng en cada reacción PCR. </li></ol> 7. Aislamiento de ARN paraPCR con transcriptasa inversa. <ol><li> El uso de un kit de purificación de ARN (Ver Tabla de Materiales), siga las instrucciones del fabricante para aislar ARN a partir de células de levadura utilizando un minibeadbeater. </li><li> Cuantificar la concentración del ARN midiendo la absorbancia a 260 nm (260 A una lectura de 1,0 es equivalente a ~ 40 mg / ml de ARN monocatenario). </li><li> El uso de un kit de RT-PCR (Ver Tabla de Materiales), siga las instrucciones del fabricante para configurar las reacciones de RT-PCR con aproximadamente 1 g de ARN. Para los resultados obtenidos en este estudio, el uso de los cebadores listados en la Tabla 1. </li></ol>

<ol><li>Price, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptococcusneoformans+requires+a+functional+glycolytic+pathway+for+disease+but+not+persistence+in+the+host%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Cryptococcusneoformans requires a functional glycolytic pathway for disease but not persistence in the host.</a> MBio. 2, e00103-e00111 (2011).</li>
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<li>Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementation+of+a+capsule-deficient+mutation+of+Cryptococcus+neoformans+restores+its+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Complementation of a capsule-deficient mutation of Cryptococcus neoformans restores its virulence.</a> Mol Cell Biol. 14, 4912-4919 (1994).</li>
<li>Del Poeta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+I+is+essential+in+Cryptococcusneoformans%3A+role+In+pathobiology+and+as+an+antifungal+target%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase I is essential in Cryptococcusneoformans: role In pathobiology and as an antifungal target.</a> Genetics. 152, 167-178 (1999).</li>
<li>McClelland, C. M., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+transformation+of+Cryptococcusneoformans+and+Cryptococcusgattii+by+Agrobacteriumtumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet+Biol%3AFG+%26+B%22%5BJournal%5D)">High frequency transformation of Cryptococcusneoformans and Cryptococcusgattii by Agrobacteriumtumefaciens.</a> Fungal Genet Biol:FG & B. 42, 904-913 (2005).</li>
<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+%27DiOlistic%27+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li>
<li>Nicola, A. M., Frases, S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipophilic+dye+staining+of+Cryptococcusneoformans+extracellular+vesicles+and+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Lipophilic dye staining of Cryptococcusneoformans extracellular vesicles and capsule.</a> Eukaryot Cell. 8, 1373-1380 (2009).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

Utilizando este protocolo, se puede lograr una transformación biolítica en la que el ADN lineal se integra en un locus deseado en el genoma de Cryptococcus neoformans mediante recombinación homóloga. Ciertos pasos en el protocolo pueden tener un efecto dramático en la efectividad / eficiencia de la transformación. Para una transformación exitosa, es imperativo que el ADN utilizado en el brote tenga una concentración de al menos 1 μg. Sin embargo, el volumen de ADN agregado a las perlas de oro se puede aumentar e...

Cryptococcus neoformans, un patógeno oportunista invasor del sistema nervioso central, es la causa más frecuente de meningitis fúngica que provoca más de 625.000 muertes al año en todo el mundo 1. Se ha demostrado que el acetato es un importante producto de fermentación durante la infección criptocócica 2,3,4, y se ha demostrado que los genes que codifican enzimas de tres vías putativas productoras de acetato se regulan al alza durante la infección 5. Esto sugiere que la producción y el transporte de acetato pueden ser una parte necesaria y requerida del proceso patógeno; Sin embargo, aún no se comprende la importancia de esto. Una posible vía para la producción de acetato es la xilulosa 5-fosfato/fructosa 6-fosfato fosfocetolasa (Xfp)-acetato quinasa (Ack), una vía que anteriormente se pensaba que solo estaba presente en bacterias, pero recientemente identificada tanto en hongos euascomicetos como en hongos basidiomicetos, incluido C. neoformans 6.
Para determinar la localización de estas enzimas de esta vía en la célula, se introducirá en C. neoformans un constructo que lleva un gen de resistencia a la neomicina aguas abajo de una fusión de genes ACK con la etiqueta fluorescente mCherry (ACK:mCherry:Neo) utilizando el método bien establecido de transformación biolística 7,8. Aunque la electroporación es un método eficiente para la transformación de plásmidos que se mantendrán como episomas en Cryptococcus 9, no es útil para crear transformadores homólogos estables 8. Solo la administración biológica mediante una pistola de genes proporciona un medio eficaz para transformar ADNs lineales que se integrarán en el genoma por recombinación homóloga. Por ejemplo, Edman et al. demostraron que de los transformantes resultantes de la electroporación de un marcador seleccionable URA5 transportado por plásmidos en mutantes ura5 de C. neoformans, solo entre el 0,001 y el 0,1% de los transformantes eran estables 9. Chang et al. lograron solo una eficiencia de transformación estable del 0,25% utilizando electroporación para reconstituir la producción de cápsulas en un mutante acapsular 10. A diferencia de la electroporación, se ha demostrado que la transformación biolística da lugar a una eficiencia de transformación estable del 2-50% dependiendo del gen que se esté alterando 7,8,11. 
Este experimento visual proporcionará una demostración paso a paso de la transformación biolística de la construcción lineal de ADN ACK:mCherry:Neo en C. neoformans, y describirá cómo confirmar su correcta integración a través de la recombinación homóloga en el locus ack. El protocolo que se muestra aquí es una modificación del método desarrollado en el laboratorio Perfect 8.

<table><tbody><tr><td>0,6 y mu; m cuentas</td><td>de oro Bio-Rad</td><td>165-2262</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>base sin espermadina</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S0266</td><td>https://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>G418 - Sulfato (Neomicina)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>G-418-10</td><td>www.goldbio.com</td></tr><tr><td>Higromicina</td><td>Gold Biotechnology</td><td>H-270-1</td><td>www.goldbio.com</td></tr><tr><td>1350 psi Discos de ruptura</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2330</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>Cribas de parada</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2336</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>Discos de macroportadores</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2335</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>YPD Caldo</td><td>Becton Dickinson & Co.</td><td>242820</td><td>www.bd.com</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Becton Dickinson & Co.</td><td>214530</td><td>www.bd.com</td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP439</td><td>http://www.fishersci.com</td></tr><tr><td>PDS-1000/He Sistema</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>http://www.bio-rad.com Zeiss</td><td>Axio</td><td>http://www.zeiss.com/microscopy</td></tr><tr><td>KOD Kit de PCR de un paso</td><td>EMD Millipore</td><td>71086-4</td><td>http://www.emdmillipore.com</td></tr><tr><td>uno Kit de RT-PCR paso</td><td>Qiagen</td><td>210212</td><td>www.qiagen.com</td></tr><tr><td>Wizard Kit de purificación de ADN genómico</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>www.promega.com</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>www.qiagen.com</td></tr><tr><td>Mini Beadbeater - 1</td><td>BioSpecs</td><td>3110BX</td><td></td></tr><tr><td>http://www.biospec.com Microfuge 18 Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>F241.5P</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro de microplacas</td><td>www.beckmancoulter.com BioTek</td><td>EPOCH</td><td>www.biotek.com</td></tr></tbody></table>

transformación biolística de un fluorescente tagged gen en el oportunista por hongos patógenos<em&gt; cryptococcus neoformans</em

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

El basidiomycete Cryptococcus neoformans, un patógeno oportunista invasivo del sistema nervioso central, es la causa más frecuente de meningitis fúngica en todo el mundo como resultado más de 625.000 muertes al año en todo el mundo. Aunque la electroporación se ha desarrollado para la transformación de los plásmidos en Cryptococcus, sólo entrega biolística proporciona un medio eficaz para transformar ADN lineal que se puede integrar en el genoma por recombinación homóloga. Acetato ha demostrado ser un importante producto de fermentación durante la infección criptocócica, pero la importancia de esto todavía no se conoce. Una vía bacteriana integrada por los enzimas xilulosa-5-fosfato / fructosa-6-fosfato fosfocetolasa (Xfp) y acetato quinasa (ACK) es una de las tres vías posibles para la producción de acetato en C. neoformans. Aquí, nos demuestran la transformación biolística de una construcción,que tiene el gen que codifica Ack fusionado a la etiqueta fluorescente mCherry, en C. neoformans. Entonces Confirmamos integración de la fusión ACK -mCherry en el locus ACK.

Una transformación biolística exitosa de C. neoformans se pueden obtener siguiendo este esquema de protocolo (Figura 1). Con la transformación biolística, una sesión con éxito de las perlas de oro recubiertas se indica mediante un anillo de oro visible en la placa después de la DNA es disparo (Figura 2A). Las colonias deben aparecer dentro de 4 a 5 días cuando se deja a temperatura ambiente después de la siembra las células recuperadas de las placas de sorbitol YPD + 1M en medi...

Transformación biolística es un método utilizado para generar la integración estable de ADN en el genoma de los oportunistas neoformans patógeno Cryptococcus través de la recombinación homóloga. Vamos a demostrar la transformación biolística de una construcción, que tiene el gen que codifica acetato quinasa fusionado a la mCherry etiqueta fluorescente en C. neoformans.

Transformación biolística de un fluorescente Tagged gen en el oportunista por hongos patógenos<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar una demostración paso a paso de la transformación biótica de una construcción lineal que contiene una etiqueta fluorescente. Esto se logra recubriendo primero las cuentas de oro de los microcoches con el ADN de interés. En el segundo paso, el ADN se transfiere a las células C neo forina mediante una pistola de genes.A continuación, se colocan las células transformadas en placas y se evalúa la integración de la construcción de ADN mediante PCR y R-T-P-C-R. En última instancia, la microscopía fluorescente se utiliza para confirmar la integración adecuada del producto de ADN a través de la recombinación homóloga. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la electroporación, es que la transformación BIC da como resultado una integración estable en el genoma de la criptooficina.Casi rendimiento. Quien demuestra esta técnica es Tanya Taylor, una estudiante de doctorado en mi laboratorio que se ha vuelto experta en esta técnica. Comience usando pinzas para sumergir los discos BIC macroportadores de naranja en etanol al 100%, luego transfiera los discos a una placa de Petri grande que contenga un secado

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Uso de imágenes in vivo para detectar fenotipos de morfogénesis en cepas mutantes de Candida albicans durante la infección activa en un huésped mamífero

Este protocolo emplea un reportero bioluminiscente, lo que permite mediciones de la actividad transcripcional en Saccharomyces eubayanus para monitorear la transición de glucosa a maltosa, lo que permite el análisis en tiempo real de las adaptaciones metabólicas y apoya la optimización de la cepa para la fermentación industrial en diversas condiciones.

In vivo Monitorización de la actividad transcripcional durante la transición metabólica mediante un reportero bioluminiscente en levadura

Aprende la transformación biolística para integrar ADN en Cryptococcus neoformans usando microportadores de oro y pistola de genes. Este método permite la integración estable mediante recombinación homóloga.

Transformación biolística de un fluorescente Tagged gen en el oportunista por hongos patógenos

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