脈絡叢上皮細胞の繊毛運動の観測

本実験の全体的な目的は、脈絡叢上皮細胞の繊毛のex vivoにおける運動を解析することです。まず、マウス胚または幼若マウスから脳を摘出し、脈絡叢組織を単離します。繊毛の運動を微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡で可視化し、繊毛先端のデジタル動画を撮影して、繊毛先端の位置を手動でトラッキングします。

最終的に、再構成された繊毛（Cilia）の先端運動は、その運動パターンに基づいて分類および定量化されます。この手法は、発生過程において繊毛の生存率がどのように制御されているか、また、可動性のパターンが時間とともにどのように変化するかといった、細胞生物学における重要な疑問への回答に寄与します。これらの技術の応用範囲は、病態生理学的解析および診断にまで及びます。

シリアに関連する疾患についての基礎的な動力学的理解はまだ不十分です。まず、断頭直後の新生子マウスを、70%エタノールで洗浄し、滅菌済みの10cmディッシュに入れた氷冷Liebowitz L-15培地で頭部を浸します。次に、時計職人用ピンセットを使用して、頭蓋骨から頭皮を取り除きます。

次に、縦方向の縫合線に沿って正中切開し、頭蓋骨を切開して脳を露出させ、続いて脳神経を切断して脳全体を回収します。分離した脳を、新鮮な氷で冷やした培地を満たした新しいディッシュに背側を上にして移し、ディッシュを実体顕微鏡下に置きます。その後、嗅球が3時の方向に来るように組織の向きを調整し、時計職人用ピンセットで脳を優しく掴みます。

もう一方の手で、微細解剖用ピンセットを用い、大脳半球と脳幹をつなぐ脳脚を切断します。大脳半球をさらに分離させるために脳頭蓋を摘出し、切断面を上に向けて配置した後、 lamina afia を牽引して、海馬の側面に付着している側脳室脈絡叢を除去します。脈絡叢を単離したら、組織を新鮮な培地を含む 35 mm ガラスボトムディッシュに移し、組織の上に重りを置いて軽く固定します。安楽死から 25 to 60 分以内に、対物レンズの焦点を視覚的に調整し、脈絡叢上皮細胞の繊毛のライブイメージングを開始してください。

コンデンサーを調整し、中心とフォーカスをケーラー照明に合わせてください。次に、DIC光学系に適合する適切な光学素子を光路に挿入します。DICプリズムを動かして画像のコントラストを調整し、組織の表面構造が明確に認識できる位置に設定します。

次に、光路をビデオカメラに切り替え、光出力を上げます。ニュートラル密度フィルタを取り除き、観察範囲と焦点を確認し、ビデオカメラの時間分解能を200 hertzに、露光時間を目的のイメージング期間に合わせて0.1 millisecondsに設定します。その後、画像スタックを取得して画像を収集します。各シングルフレームに繊毛の鮮明な画像が表示され、各繊毛の拍動パターンを手動で追跡できるようになります。

マウスポインターを使用して、各フレームにおける繊毛先端の位置をマークします。次に、適切なソフトウェアを用いて軌跡データを解析し、その軌跡を目視で「往復運動」または「回転運動」のいずれかの運動モードに分類します。公式を用いて、複数の繊毛拍動サイクルにおける繊毛拍動周波数を算出します。

同じ細胞上の他の繊毛が各繊毛の運動を妨げる可能性があるためです。次に、単一細胞内における繊毛拍動軸の角度的な均一性を分析します。往復の軌道について、繊毛先端の位置を直線に当てはめ、その直線とX軸とのなす角をthetaとして定義します。

回転軌道については、楕円に位置をフィットさせ、楕円の長軸がx軸となす角をthetaとして定義します。最後に、各軌道を定量的に記述するため、軌道をthetaだけ回転させ、x軸方向とy軸方向の分布幅の比をアスペクト比として定義します。この最初のクリップでは、高速ビデオ顕微鏡で撮影した生後2日目のマウス幼仔の脈絡叢上皮細胞と繊毛の上面図が示されています。脈絡叢組織の表面が不規則であるため、焦点面内と焦点面外の両方で可視化されています。

この2番目のクリップでは、前の動画の枠で囲まれた領域を拡大して表示しており、個々の繊毛が見せる回転および往復運動をより詳細に観察することができます。ここでは、複数サイクルにわたる動画記録から再構成された代表的な繊毛先端の移動軌跡とともに、先端位置のx座標とy座標の時間経過をグラフにプロットして示しています。これらのグラフにおいて2つの座標間の位相差を実証するため、x座標とy座標を正規化して重ね合わせました。

運動性のCLIAはライブイメージングで容易に認識できますが、非運動性のCLIAをこの方法で特定することは困難です。この困難を克服するために、走査電子顕微鏡は、運動性の有無にかかわらずCLIAの全体像を得るために不可欠です。この手順を行う際は、サンプルの新鮮さを維持し、Syriaの運動性を保持できるよう、速やかに解剖を行うことが重要です。

このビデオを視聴することで、ウイルス含有シリアルを用いた組織サンプルの調製方法、およびex vivoにおける死亡率のモニタリングと定量化の方法について、十分に理解することができます。