Name: 마이크로 전극 배열에 3D 엔지니어링의 연결을 문화의 인터페이스 : 혁신을 체외 실험 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 학습하세요 3D 신경망을 마이크로 전극 배열(MEA)에 결합하는 혁신적인 체외 실험 모델을 구축하는 방법을. 유리 마이크로비드를 지지체로 활용하여 생리학적으로 더 적절한 환경에서 신경 활동을 연구합니다.

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저자는 감금 구조와 dott 개발 기술 지원 조르지오 Carlini 감사합니다. 원고의 철저한 개정 ORNELLA LoBrutto. 이러한 결과로 이어지는 연구는 유럽 연합 (EU)의 7 ​​번째 프레임 워크 프로그램에서 자금을받은 (ICT-FET FP7 / 2007-2013, FET 젊은 탐험가 계획) 보조금 협정 284772 뇌 활에서 (www.brainbowproject.eu).

실험 프로토콜은 DL 1,992분의 116에 따라와 제노바 (보호 해주는 대학의 지침에 의해 건강의 이탈리아 교육부 유럽 동물 관리 규정 (63분의 2,010 / EU)에 의해 승인되었다. N. 13130​​, 월 2011). 모든 노력이 프로젝트 동물의 수를 줄이기 위해 자신의 고통을 최소화 하였다. 재료 및 지지대 1. 준비 <ol><li> CNC (컴퓨터 수치 제어) 밀링 머신에 의해 PDMS (폴리 디메틸 실록산) 제약 조건을 구축 할 수있는 틀을 구축합니다. 이러한 몰드는 폴리 테트라 플루오로 에틸렌의 중앙 실린더 (PTFE), 폴리 카보네이트로 실현된다. PDMS가 강화되면이 물질은 마스크의 쉽게 추출 할 수 있습니다. 주 : 주형의 설계는 컴퓨터 지원 설계 (CAD)에 의해 수행하고 CNC 밀링 머신에 전달되었다. </li><li> PDMS 엘라스토머를 준비합니다. PDMS는 유기 폴리머이다. 그것은 두 가지 요소로 구성되어있다경화제 및 중합체. 1:10 부피비로 섞는다, 경화제의 일부 및 중합체의 아홉 부품. , 페트리 접시에서 두 성분을 넣어 진탕하고 기포를 제거하기 위해 10 분 동안 진공 챔버에서 믹스를 삽입한다. PDMS의 3g 하나의 제약 조건에 대한 충분하다. </li><li> PDMS 제약을 구축합니다. 성형기에 PDMS 재료를 넣고 120 ℃에서 30 분 동안 오븐에 넣어. PDMS 제약은 각각 22.0 및 3.0 mm의 외부 및 내부 직경 650 ㎛의 높이를 갖는 원통의 이상적인 형상을 갖는다. </li><li> 도금 하루 전에, 커플 실체 현미경 집게 의해 마이크로 전극 어레이 (다자간)의 활성 영역에 마스크 및 120 ° C의 오븐에서 PDMS 마스크 살균. </li><li> 원추형 바이알에 2 시간 동안 70 %의 에탄올 및 EV 회전 (42.3 ± 1.1 μm의 평균 직경의 인증을 40 ± 2 ㎛의 공칭 직경) 유리 마이크로 비드를 살균ERY 30 분 모든 마이크로 비드를 노출합니다. </li><li> 유리 병에서 에탄올 용액을 제거하고 마이크로 비드를 멸균 수로 2 회 씻어. </li><li> 0.05 ㎍ / ㎖의에 폴리 -D- 라이신과 라미닌 혼합액 24 μL와 (직경이 3.0 mm로 동일) PDMS 마스크로 구분 MEA 영역의 중앙 부분을 컨디셔닝. </li><li> 코트 0.05 μg의 /에서 접착 단백질, 라미닌 및 폴리 D 라이신과 마이크로 비드 용액과 안정하고 오래 지속되는 신경 네트워크를 획득하기 위해, 37 ℃ 배양기에 밤새두​​고 그들. </li><li> MEA의 유리 표면으로부터 유리 마이크로 비드에서 모두 접착 인자를 제거한다. 대기음 피펫 코팅 용액의 약 95 % 및 MEA 표면에 멸균의 작은 부피 - 24μl- 적용. 대기음은 다시 95 개 이상의 물 %와 세포를 도금하기 전에 1 시간 동안 층류 후드 아래 MEA 건조를 할 수 있습니다. 주 : 대신 마이크로 비드의 경우, 코팅 대기음용액 및 뉴런 도금한다 유리 표면을 컨디셔닝하기 위해, 멸균 수와 기본 배지와 같은로서의 B27 보충제와 두 번째 세척으로 제를 만든다. 마이크로 비드가 건조하게하지 마십시오. 유리 병 내부의 배양액에 부유을 남겨주세요. </li><li> 그들이 균일 한 층을 형성하는 자기 - 조립된다 멤브레인 삽입물 (구멍 직경 0.4 μm의)와 멀티 웰 플레이트에 피펫 -200 μl-, 처리 된 마이크로 비드 현탁액 (약 32,000)을 이용하여, 배포. </li><li> 매체의 0.5 ml의 멤브레인의 각 웰을 입력하고 인큐베이터에 넣어 (T = 37.0 O C, CO 2 = 5 %) 뉴런 (3.2) 도금 될 준비가 될 때까지. </li></ol> 2. 태아의 해부 및 조직의 해리 <ol><li> 일반 명암 일정에 따라 일정한 온도 (22 ± 1 ℃로)과 상대 습도 (50 %)에서 하우스 성인 여성 쥐 (2백~2백50그램) (빛에 오전 7시에서 오후 7시까지)에서동물 시설. 그 음식을 확인하고 물을 자유롭게 사용할 수 있습니다. </li><li> 3 % 이소 플루 란을 사용하여 개발 십팔일 (E18) 후 임신 여성 쥐를 마취. 그 후, 경부 탈구에 의해 동물을 희생. </li><li> 각 쥐의 배아에서 해마를 제거하고 칼슘과 마그네슘없이 얼음 차가운 행크의 균형 염 용액 2+에 배치합니다. 하루에 개발 해마와 피질 조직 (18)는 매우 부드럽고 작은 조각으로 절단 할 필요가 없습니다. 더 자세한 사항은 18, 19을 찾을 수있다. </li><li> 37 ℃에서 18-20 분 동안 DNase의 0.05 %를 함유하는 트립신 / 행크 용액의 0.125 %로 조직을 해리. </li><li> 파스퇴르 피펫으로 상층 액을 제거하고 5 분 동안 10 % 소 태아 혈청 (FBS)와 매체를 첨가하여 효소 소화를 멈춘다. </li><li> FBS로 배지를 제거하고 그 보충, 1 % L- 글루타민, 10 μg의 겐타 마이신 / ㎖와 배지로 한번 세척 하였다. 파스퇴르 핍 다시 매체를 제거두기가 보충은, 1 % L- 글루타민, 10 μg의 겐타 마이신 / ㎖와 함께 성장 배지의 소량 (500 μL)로 다시 채우고. </li><li> 세포의 유백색 현탁액 명백한까지 좁은 파스퇴르 피펫 기계적 조직 펠렛을 해리. 이 세포 현탁액을 원심 분리 할 필요가 없다. </li><li> 2.0 ㎖의 최종 부피를 얻기 위해 생장 배지로 세포 현탁액의 소량 희석. 혈구 챔버와 얻어진 세포의 농도를 계산합니다. / μL 600-700 세포의 원하는 세포 농도를 얻기 위해, 5 : 1에서 이러한 농도를 희석. </li></ol> 3. 셀 도금 <ol><li> PDMS 제약 조건에 의해 정의 된 MEA의 활성 영역 상에 약 2,000 세포 / mm 2의 밀도로 접시 세포는 2D 신경 네트워크를 생성한다. 참고 : 각 해마는 약 5 × 10 5 세포를 포함, (하나의 배아에 대한 1 × 6). 6 × 10의 총량을 얻기 위해 6 배아를 해부하다6 2 ㎖ 중의 세포 및 / μL 3,000 세포의 추정 농도. 원하는 세포 농도를 구하고 약 600-700 세포 / μL 판형 위해 5 : 1에서 이러한 농도를 희석. PDMS 제약으로 구분 MEA 영역은 약 7.065 mm (2) 및 도금 된 세포의 총 수의 경우 600 세포 / μL X 24 μL = 14,400 세포 / mm 2 2,038 세포의 최종 농도. </li><li> 37 ℃에서 가습 이산화탄소 분위기 (5 %)와 인큐베이터에 MEA 장치를 놓습니다. </li><li> 삼차원 배양 건설 예비 단계를 완료하기 위해 멀티 웰 플레이트 내부에 위치 된 마이크로 비드 단층의 표면 상 / μL 600-700 세포 (약 100,000 세포)의 세포 농도로 현탁액 160 μl를 배포한다. 37 ℃에서 가습 이산화탄소 분위기 (5 %)로 인큐베이터에서 멀티 웰 플레이트를 넣습니다. </li></ol> 4. 3D 신경 네트워크 구축 <ol><li> 6-8 시간 도금 후, 약 30 ~ 40 μL의 볼륨 설정 피펫을 사용하여 PDMS 제약에 의해 구분 된 지역 내에서 매우 신중하게 멀티 웰 플레이트에서 서스펜션 (신경 세포와 마이크로 비드)를 전송합니다. 각 전송 후에, 육각형 컴팩트 한 구조로 자기 조립에 마이크로 비드를 허용, 절반 잠시 기다립니다. </li><li> 모든 층들이 증착되고 자발적 조립되면, 매체의 약 300 μL PDMS 제약으로 구분 영역의 상부의 큰 방울 리필. </li><li> 인큐베이터 (T를 = 37.0 O C, CO 2 = 5 %)을 MEA에 연결된 3 차원 구조를 넣어 48 시간 동안 그 보충하여 성장 배지 배양의 최종 부피 (약 1ml)에 추가하기 전에. 참고 : 막 삽입 (30,000) 및 MEA 장치 (6000) 상에 단일 층에 구슬의 수와 멀티 웰 플레이트에 구슬의 수를 고려한다. 생성 된 3 차원 구조는 MI의 5 층으로 구성되고crobeads 세포. 3D 신경 네트워크는 기하학적으로 완전한 아니라고 고려하여, 결과적인 3D 구조는 5~8 층으로 구성 될 수있다. </li><li> 날은 도금 후, 조심스럽게 MEA 링 내부의 중간 (약 900 μL)의 최종 부피를 추가합니다. 4~5주 동안 37 ° C에서 CO 2의 가습 분위기 (5 %)의 3 차원 배양을 유지한다. 일주일에 한 번 매체의 절반을 교체합니다. </li></ol> 5. 공 초점 현미경 취득 <ol><li> 홀더 현미경의 단계로 생물학적 샘플을 수정합니다. 정확한 대역폭 방출 필터와 순서를 캡처 할 각 이미지에 대한 PMT의 화상, 이득 및 오프셋 (-0.3 %)을 획득하는 레이저 (아르곤 4백96에서 5백55까지 ㎚), 스캔 속도 (400 Hz에서) 설정할 포화를 방지하고 신호대 잡음비를 증가시키기 위해. 결과 섹션은도 4의 이미지를 획득하는 데 사용되는 값을보고한다. </li><li> Z -stack 순서, 전나무의 취득ST는, 상부 및 샘플의 하부 층의 Z 위치의 값을 선택하고 획득하게 스텝 사이즈를 선택한다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

본 연구에서는 3 차원으로 구성 체외 플랫폼에서 새로운 실험 네트워크 전기 생리학에 대한 다자간가 제시되었다 결합의 연결을 문화를 설계. Z 방향을 따라 이동시킴으로써 행한다 신경 염성 생장을 허용하는 지지체로서 마이크로 비드의 사용은 평면 MEA와 일체화되도록 맞추어왔다. 이러한 방식으로, 유효하고 신뢰성있는 시험 관내 3D 모델에서 얻어진 마이크로 시스템 결과 출사 전기 생리 16 역학을 연구. MEA 녹화 셋업 MEA 장치는 전기 활성 조직으로부터의 세포 외 신호를 측정 할 수있는 기판 매립 마이크로 전극 배열로 통합 배양 챔버로 구성된다. 전형적인 기록 신호 (즉, 단일 문헌 임계 전압 하나 이상의 뉴런의 전기적 활성도의 변화를 나타내는) 및 버스트 (즉, 높은 충전 스파이크 시퀀스 종종 occurrin 스파이크 이루어...

마이크로 전극 배열 (다자간)에 결합 된 생체 외 2 차원 신경망에서 신경 역학과 기본 연결 사이의 상호 작용을 연구하기 위해 채택 금 표준 실험 모델을 arethe. 개발하는 동안, 신경이 잘 표시 복잡한 네트워크를 다시 definedspatio-temporalpatternsof 활동 1, 2 (즉, 버스트, 네트워크 버스트, 임의의 급상승 활동). MEA의 네트워크 레벨에서 표현의 상세한 역학 조사를 허용 많은 위치에서 (수십 마이크로 전극으로부터 수천) 전기 생리 활성을 기록한다. 또한, 해리 배양의 사용은 설계 - 네트워크를 설계 할 possibile 만든다. 이것은 이런 식으로 이해하기 쉽게 기록 전기 생리 활성 간의 기능적 관계 및 셀 밀도 3, 4, 5의 모듈화 정도, 이종 신경 팝의 존재 등의 네트워크 조직의 파라미터등 ulations 6 그러나, 배양 된 세포에 해리 된 모든 시험 관내 시험은 2D 신경 네트워크에 기초한다. (7) 모든 방향으로 확대 할 수 평탄화되어 2D 모델 인 somata 성장 콘 (I) 및 축색 돌기 - 생장이 방법은 생체 내 (본질적으로 3 차원, 3D) 시스템에 대해 oversimplifications 리드. (II) 2D 체외 네트워크 전시는 네트워크 (8)의 신경 세포의 대부분을 포함하는 활동을 파열에 의해 지배 전기 생리 역학에 박힌. 최근, 다른 솔루션은 3D는 신경 네트워크를 해리 체외의 구성을 허용하도록 개발되었다. 일반적인 생각은 신경 세포는 3D 방식으로 성장할 수있는 발판을 만드는 구성되어 있습니다. 이러한 지지체는 고분자 겔 및 고체 다공성 매트릭스 9-13로 실현 될 수있다. 중합체의 기계적 특성을 이용함으로써, 내부 살전 세포를 포함 할 수있다neurosphere를 11의 3D 문화의 균일 한 블록을 정의하여 전자 구조. 이 방법의 주요 특징은 neurosphere를 9,12-의 강성, 기계적 특성이다. 그러나, 이들 물질은 기공률이 제한되어, 그들은 매트릭스 내부 세포 이동을 보장하지 않는다. 이러한 단점을 극복하기 위해, 가능한 해결책은 &#39;단위&#39;모듈로 매트릭스를 슬라이스로 구성되어 있습니다. 불행히도, 입자의 크기 및 형상은 다양 정규 층상 구조로 포장을 방해 할 수있다. 7에서 컬린과 동료 생리 활성 세포 외 기질 기반의 발판 내에서 뉴런 및 / 또는 성상 세포로 이루어진 3 차원의 연결 구조를 설계했다. 이러한 설계 신경 조직은 3 차원 미세 환경 내에서 신경 생물학적 반응을 연구하고 조작하는 체외 조사에있었습니다. 이 모델은 세포 외 기질 (ECM) 및 / 또는 하이드로 겔 지지체 (500-600 μm의 두께)에 걸쳐 분산 뉴런 및 아교 세포로 구성되었다. 이 공동으로/ mm 3 5,000 세포 - ndition, 최적의 세포 생존율 (90 % 이상)은 약 3,750의 최종 밀도로 세포를 플레이 팅에 의해 발견되었다. 그러한 밀도 값은 마우스 뇌 피질의 세포 밀도는 약 90,000 세포 / 14 mm 3 인 생체 조건에서 하나보다 훨씬 낮다는 것을 주목해야한다. 이러한 제한을 극복 Pautot 15은 셀 밀도와 네트워크 연결이 네트워크의 실시간 영상을 가능하게하면서 생체 조건에서 비슷하게 제어되는 3D 관내 시스템을 실현 동료에게. 실제로,이 방법은 배양 된 신경 세포는 실리카 마이크로 비드에 성장 할 수있는 해리 개념을 기반으로합니다. 이 구슬을 준수하는 신경 세포 기관 및 성숙, 성장, 확장, 다른 뉴런 시냅스 연락처를 정의하는 그들의 arborizations만큼 큰 성장 표면을 제공한다. 이 방법은 FO하는 단 분산 비드의 자발적인 조립 성질을 이용RM 차원이 다른 구슬에 신경 세포 사이의 제한된 연결과 다른 층에 신경 세포의 고유 한 하위 집합을 포함하는 육각형 배열을 계층. 이 방법으로 달성 세포 밀도는 / mm 3 약 75,000 세포이었다. 최근에, 우리는 다자간 16 Pautot의 방법을 적응 : 얻어진 결과는 3D 전기 생리 활동이 2D 네트워크에 의해 표현 된 것보다 활동의 폭 넓은 레퍼토리를 제시 것으로 나타났다. 3D 성숙한 문화가 향상된 동적을 전시하는 네트워크 버스트 임의 스파이크 활동이 공존하는 모두. 마찬가지로, 탕-Schomer 동료 17 개월 일부 체외에서 일차 피질 배양을 유지 실크 프로테인 계 다공성 지지체를 실현하고, 텅스텐 전극에 의해 전기 생리 활성을 기록했다. 이 연구에서, 실험 절차는 MEA를 결합 3D 신경 네트워크를 구축하는 것이 설명 될 것이다.

<table><tbody><tr><td>라미닌</td><td>시그마-알드리치</td><td>L2020</td><td>0.05 &마이크로; g/ml</td></tr><tr><td>폴리-D-라이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>P6407</td><td>0.05 &마이크로; g/ml</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25050-014</td><td>0.125% 희석 1:2 w\o CA++, MG++</td></tr><tr><td>DNAase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td>0.05% 희석&nbsp; Hanks 용액</td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco Invitrogen 21103049</td><td></td><td>배양 배지</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>17504044</td><td>2% medium supplent</td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-2442</td><td>10%</td></tr><tr><td>Glutamax-I&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>0.5 mM</td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G.1272</td><td>5 mg/L</td></tr><tr><td>폴리-디메틸-실록산(PDMS)</td><td>코닝 시그마</td><td>481939</td><td>경화제 및 고분자</td></tr><tr><td>마이크로 전극 어레이</td><td>다중 채널 시스템(MCS)</td><td>60MEA200/30-Ti-pr</td><td>MEA 포함: 전극 그리드 8x8; 전극 간격 및 직경 200 및 30 &마이크로; m을 각각 사용합니다. 실이 없는 플라스틱 링</td></tr><tr><td>Microbead</td><td>Distrilab-Duke Scientific</td><td>9040</td><td>&nbsp; 1 gr 유리 부품. 크기 Stds 40 &micro; 멤브레인</td></tr><tr>인서트가 있는<td>트랜스웰</td><td>코스타 시그마</td><td>CLS 3413</td><td>멀티웰 플레이트(직경 6.5mm, 다공성 0.4 &마이크로; m)</td></tr><tr><td>HBSS w\o Ca++ ,Mg++&nbsp;</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>14175-052</td><td></td></tr><tr><td>행크 버퍼 솔루션&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>테플론</td><td>시그마</td><td>430935-5G</td><td>폴리테트라플루오로에틸렌</td></tr><tr><td>쥐</td><td>스프라그 Dawley</td><td>Wistar 쥐</td><td></td></tr><tr><td>공초점 현미경 Upright</td><td>Leica</td><td>TCS SP5 AOBS</td><td></td></tr><tr><td>20.0x0.50 물 목표</td><td>Leica Leica</td><td>HCX APO L U-V-I&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>40.0x0.80 물 대물</td>렌즈 <td>라이카</td><td>라이카 HCX APO L U-V-I&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>25.0x0.95 물 목적</td><td>Leica</td><td>HCX IRAPO L</td><td></td></tr></tbody></table>

마이크로 전극 배열에 3d 엔지니어링의 연결을 문화의 인터페이스 : 혁신을<em&gt; 체외</em&gt; 실험 모델

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

현재 세포 외 마이크로 트랜스듀서 장치에서 체외에서 성장 및 발달하는 해리된 뉴런에서 파생된 대규모 네트워크는 뉴런 세포 어셈블리의 형성 및 유지와 관련된 기본 신경 생리학적 메커니즘을 연구하기 위한 황금 표준 실험 모델입니다. 그러나 체외 연구는 2차원(2D) 신경망에 의해 생성된 전기생리학적 활성을 기록하는 것으로 제한되었습니다. 그럼에도 불구하고 구조와 역학 사이의 복잡한 관계를 감안할 때 3차원(3D) 네트워크의 형성과 발전하는 역학을 조사하기 위해서는 상당한 개선이 필요합니다. 이 연구에서는 3D 해마 또는 피질 네트워크가 평면 MEA(Micro-Electrode Arrays)에 결합되는 새로운 실험 플랫폼을 제시합니다. 3D 네트워크는 유리 마이크로비즈(직경 30-40μm)로 구성된 골격에 뉴런을 파딩하여 구현되며, 이 골 위에서 뉴런이 성장하고 상호 연결된 복잡한 3D 어셈블리를 형성할 수 있습니다. 이러한 방식으로 예상되는 최종 셀 밀도를 가진 5-8개의 레이어로 구성된 엔지니어링된 3D 네트워크를 설계할 수 있습니다. 3D 어셈블리의 형태학적 조직의 복잡성이 증가함에 따라 이러한 유형의 네트워크가 표시하는 전기생리학적 패턴이 향상됩니다. 고정관념이 높은 파열 활동이 나타나는 표준 2D 네트워크와 비교했을 때, 3D 구조는 지속 시간과 빈도 측면에서 파열 활동을 변경할 뿐만 아니라 더 많은 무작위 스파이크 활동을 관찰할 수 있습니다. 이러한 의미에서 개발된 3D 모델은 생체 내 신경망과 더 유사합니다.

.이 실험 절차에서 중요한 역할 3D 신경 네트워크의 성장을위한 기계적 지지체를 정의하는 마이크로 비즈에 의해 재생되는 1a 및 B 화면을 마이크로 비드의 배열 (40 ± 2 ㎛의 공칭 직경도]의 인증 평균 직경 평면에서 42.3 ± 1.1 μm의). 이러한 구조의 특수성은 마이크로 비드가 자발적으로 소형 육각형 형상 (그림 1B 및 C)를 정의하는 자기 조립이다. 이렇게 생성 된 지지체는 신경 돌기 및 균체의 대사 교환 충분히 큰 격자 공간을위한 일관된 성장 표면을 보장한다. 이 마이크로 비드 치수는 간질 간격 및 최종 신경 세포 밀도에 대한 합리적인 타협으로 증명한다. PDMS 구조는 &quot;이상적인&quot;실린더를 재현하고 컴팩트 육각형 구조의 영향 인자 (HPF) (40) 이후의 구슬의 최대 수 (직경 0.74 같다고 고려81; PDMS 제약 내에 포함 m)은 약 10 만, 각 층 당 약 6,000 마이크로 비드에 대응하는 ...

이 연구에서는 3D 뉴런 배양이 평면 MEA(Micro-Electrode Arrays)에 결합되는 새로운 실험 모델을 presented. 3D 뉴런이 유리 마이크로비즈로 구성된 골격에 뉴런을 파종하여 네트워크를 구축하고, 그 위에서 뉴런이 자라나 상호 연결된 3D 구조를 형성합니다.

마이크로 전극 배열에 3D 엔지니어링의 연결을 문화의 인터페이스 : 혁신을<em&gt; 체외</em&gt; 실험 모델

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

본 절차의 전반적인 목표는 마이크로 전극 어레이(micro electrode arrays)와 결합된 새로운 인비트로(in vitro) 3차원 신경망 모델을 제시하는 것입니다. 이는 먼저 MEA의 중앙부를 폴리디리신(poly de lysine)과 라미닌(laminin) 혼합 용액으로 컨디셔닝한 다음, 마이크로비즈를 접착 단백질인 라미닌과 폴리리신으로 코팅함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 처리된 마이크로비즈 현탁액을 멀티웰 플레이트에 분배하여, 마이크로비즈가 스스로 조립되어 균일한 층을 형성하도록 하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 2D 신경망을 생성하기 위해 MEA의 활성 영역에 mm²당 2000개의 세포 밀도로 세포를 도말하는 것입니다. 도말 6~8시간 후, 멀티웰 플레이트에서 MEA로 현탁액을 옮기면 마이크로비즈가 육각형 밀집 구조로 자기 조립됩니다. 최종적으로, 공초점 현미경을 사용하여 3D 네트워크를 시각화하고, 이를 MEA에서 성장시킨 기존의 2D 신경망과 비교합니다.in vitro 2D 세포 배양과 같은 기존 방법들에 비해 이 기술이 갖는 주요 장점은, 2D 모델에서는 신경세포체(somata)와 성장 원추(growth cones)가 납작하게 펴지기 때문에 축삭(axon)과 가지돌기(dendrite)가 모든 방향으로 뻗어 나갈 수 없다는 점입니다. 또한, 2D 네트워크의 전기생리학적 역동성은 버스트 활동(bursting activity)이 지배적인 반면, 3D 네트워크에서는 무작위 스파이킹 활동(random spiking activity) 또한 공존합니다. 저희는 2008년 Nature Method에 게재된 Sophie Potto의 연구 논문을 읽었을 때 이 방법의 아이디어를 처음 얻었으며, 해당 논문에서 그녀는 3차원 신경 네트워크를 구축하기 위한 지지체로 MICROBITS를 사용했습니다.그런 다음 우리는 처음으로 3차원 인 비트로(in vitro) 기록을 수행하기 위해 이 방법을 수정하였습니다. PDMS 엘라스토머를 준비하려면, 페트리 접시에 경화제와 폴리머를 1:9 부피비로 혼합합니다. 그다음 혼합물을 흔들어 섞은 후, 기포를 제거하기 위해 진공 챔버에 10분 동안 둡니다.PDMS 제약 구조물을 제작하려면, PDMS 재료를 몰더에 넣은 후 120 °C의 오븐에서 30분 동안 가열합니다. PDMS 제약 구조물은 플레이팅 전날에 외경 22.0 mm, 내경 3.0 mm, 높이 650 µm의 원통형 모양으로 제작되어야 합니다. 실체 현미경 하에서 마스크를 MEA의 활성 영역에 결합한 다음, 120 °C의 오븐에서 PDMS 마스크를 멸균합니다.다음으로, 유리 마이크로비드를 70% Ethanol이 담긴 원추형 바이알에 넣고 2시간 동안 멸균하며, 모든 마이크로비드가 노출될 수 있도록 30분마다 회전시킵니다. 바이알에서 에탄올 용액을 제거하고 멸균수로 마이크로비드를 두 번 헹굽니다. 그런 다음 PDMS 마스크로 구획된 MEA 영역의 중앙 부분을 0.05 µg/mL 농도의 polylysine과 laminin 혼합 용액 24 µL로 코팅합니다.마이크로비드를 0.05 µg/mL 농도의 접착 단백질인 라미닌 및 폴리라이신으로 코팅합니다. 그 후, 안정적이고 오래 지속되는 신경망을 얻기 위해 37 °C 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이어서, 처리된 마이크로비드 현탁액을 멤브레인 인서트가 포함된 멀티웰 플레이트에 분주하면, 마이크로비드가 자기 조립되어 균일한 층을 형성합니다.그런 다음 멤브레인의 각 웰에 배지 0.5 milliliters를 채웁니다. 뉴런을 플레이팅할 준비가 될 때까지 37 degree Celsius, 5% carbon dioxide 조건의 인큐베이터에 넣습니다. E 18 임신한 암컷 쥐를 희생시킨 후 쥐 배아를 얻고, 각 쥐 배아에서 hippo campi를 제거합니다.이를 얼음처럼 차가운 칼슘 및 마그네슘이 없는 Hanks 균형염 용액(Hanks. Balance salt solution without calcium and magnesium)에 넣으십시오. 다음으로, 0.05% DNAse가 포함된 0.125% 트립신 Hanks 용액에서 37°C로 18분에서 20분 동안 조직을 해리하십시오.그 후, 페이퍼 파이펫으로 상층액을 제거합니다. 10% FBS가 포함된 배지를 첨가하여 5분 동안 효소 소화를 중단시킵니다. 그런 다음 FBS 포함 배지를 제거하고, 1% L-glutamine과 10 micrograms per milliliter의 Gentamycin이 첨가된 성장 배지로 한 번 세척합니다.그 후, 배지를 제거합니다. 500 µL의 성장 배지로 다시 채웁니다. 여기에는 1% L-glutamine과 10 µg/mL의 Gentamycin이 첨가되어 있습니다.세포의 우윳빛 현탁액이 나타날 때까지 좁은 PEs 피펫으로 조직 펠릿을 기계적으로 분리합니다. 그 후, 소량의 세포 현탁액을 성장 배지로 희석하여 최종 부피를 2.0 milliliters로 맞춥니다. 얻어진 세포 농도를 혈구계수기(hemo cytometer) 챔버로 측정합니다.그 다음, 마이크로리터당 600에서 700개의 세포라는 원하는 세포 농도를 얻기 위해 이 농도를 1:5 비율로 희석합니다. PDMS 제약으로 정의된 MEA의 활성 영역에 제곱밀리미터당 2000개의 세포 밀도로 세포를 도말하여 2D 신경망을 생성합니다. 이어서, MEA 장치를 37°C의 5% 습윤 이산화탄소 분위기 인큐베이터에 넣습니다.3D 배양 구축을 위한 예비 단계를 완료하려면, 마이크로비드 단층의 표면이 위치한 멀티웰 플레이트 내에 세포 농도가 600~700 cells/µL인 현탁액 160 µL를 분주합니다. 그런 다음 멀티웰 플레이트를 37 °C, 5% 습윤 이산화탄소 분위기의 배양기에 넣고, 분주 6~8시간 후에 마이크로비드와 뉴런이 포함된 현탁액 30~40 µL를 PDMS 제약으로 구획된 MEA 영역으로 옮깁니다. 각 전이 후에는 마이크로비드가 육각형 구조로 자가 조립될 수 있도록 약 30초 동안 대기합니다.PDMS 제약으로 구획된 영역 상단에 300 µL의 배지를 넣어 모든 층이 증착되고 자발적으로 조립되면, MEA와 결합된 3D 구조체를 37 °C, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 48시간 동안 배양합니다. 그 후, 보충제가 포함된 성장 배지 1 mL를 추가합니다. in vitro 배양 3주 후에는 표시된 PDMS 제약 없이도 3D 구조체가 안정적으로 유지됩니다.다음은 MEA 표면에 결합된 단층 비드의 DIC 이미지입니다. 검은색 점의 위치는 전극의 공간적 배치를 나타냅니다. 빨간색 신호로 표시된 맵 2의 면역형광 염색은 MEA의 전극 평면에 직접 결합된 마이크로비드 주변 뉴런의 수지상 돌기 분지 및 ADA 분포를 보여줍니다.이 이미지는 성숙한 분열 후 뉴런에서 발현되는 NeuN과 GABA가 라벨링된 뉴런들이 매우 밀접하게 연결된 네트워크를 보여주는 3D 배양 Zack 시퀀스의 최대 투영 영상입니다. 그리고 여기 3D 구성의 해마 네트워크에 대한 대표적인 전기생리학적 기록이 있으며, 여기 2D 구성의 해마 네트워크에 대한 대표적인 전기생리학적 기록이 있습니다.숙달되면 이 절차는 7시간 내에 완료할 수 있습니다. 다만, 이 절차는 여러 단계가 서로 다른 날에 걸쳐 수행되므로, 전체 절차를 완료하는 데 소요되는 예상 시간은 단지 참고용이라는 점에 유의하시기 바랍니다. 이 절차를 시도할 때, 먼저 MEA 전극에 뉴런 배양액의 2D 층을 도말한 다음, 3D 구조를 형성하기 위해 멀티웰 플레이트에서 microbits와 뉴런 현탁액을 MEA로 매우 조심스럽게 옮겨야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.이 기술은 계산 신경과학 분야의 연구자들이 네트워크 연결성이 창발적인 네트워크 역동성을 어떻게 형성하는지 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 미세 전극 어레이와 결합된 인비트로(in vitro) 3차원 신경망을 구축하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 설정을 돌보는에서 녹음 및 전기 MEAs의 문화를 자극하기 위해 필요한 정보를 제공합니다.

어떻게 문화, 기록 및 미세 전극 배열에의 연결을 네트워크를 자극 (MEAs)에

이 비디오는 해마 뉴런이 있는 평면 미세 전극 어레이에 결합된 3D 뉴런 배양의 발달을 보여줍니다. 분리된 뉴런은 미세 전극 어레이의 활성 영역에서 2D 네트워크를 형성하고 멤브레인 인서트가 있는 다중 웰 플레이트의 유리 마이크로비드에 부착됩니다. 이러한 뉴런 코팅된 마이크로비즈를 전극으로 전달하면 상호 연결된 3D 신경망으로 구성됩니다.

micro-electrode arrays에 결합된 3차원 뉴런 네트워크 구축

이 비디오는 MEA(Multielectrode Array)를 사용하여 3D 공동 배양 구에서 시냅스 생리를 측정하는 절차를 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 3D 구 내에서 신경망 역학 및 시냅스 네트워크 버스트 활동을 이해할 수 있습니다.

Multielectrode Arrays를 활용하여 3D 공동 배양 구에서 시냅스 생리학을 측정합니다.

이 원고는 공간적으로 제한, 기능적으로 상호 연결된 신경 회로로 구성된 체외 모듈 형 네트워크에서 성장하는 프로토콜을 설명합니다. 마스크는 폴리머 기판 위에 배양 세포 접착을 촉진하는 단백질 패턴 층을 사용한다. 도금 뉴런 코팅 분야 자발적인 연결을 설정 및 전기 생리 활성을 나타내는에서 성장.

설계, 치료, 세포 도금 및 기능적으로 간 연결 회로의 구성, 모듈 형 신경 네트워크의 배양 표면

우리는 뉴런 반응 프로파일을 연구하고 자극 매개변수를 최적화하기 위해 다중 전극 어레이에서 1차 쥐 나선 신경절 뉴런 외식재를 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 연구는 인공와우의 뉴런-전극 인터페이스를 개선하여 환자의 청력과 장치의 에너지 소비에 도움이 되는 것을 목표로 합니다.

다중 전극 배열에 나선 신경절 신경 이식편 문화 및 전기 생리학

우리는 수정하고 흥분 대뇌 피질의 뉴런 (12)에 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)의 빠른 재현, 효율적인 분화를 설명하는 이전에 게시 된 프로토콜을 구현합니다. 특히, 우리의 수정은 네트워크 레벨에서의 전기 생리 학적 특성을 측정하기위한 마이크로 - 전극 어레이의 신경 세포 밀도 및 사용의 제어를 허용한다.

마이크로 전극 배열에 네트워크 활동을 측정하기위한 유도 다 능성 줄기 세포의 빠른 신경 세포의 분화

이 프로토콜에서 결합 해리 인간의 pluripotent 줄기 세포 파생 뉴런에 대 한 재현 방법에 설명 하 고 이다 3D에 범위 cocultures, 무료 부동 조건, 그리고 이후 이러한 분야를 유지 하 immunoanalysis와 multielectrode 배열 녹음 분야의 측정 시 냅 스 회로 활동.

3D Cocultures 이다 인간 만능 줄기 세포에서 신경 세포의 시 냅 스 마이크로 회로 모델링

이 프로토콜 신경 문화에 활동 전위 전송 공부에 대 한 미세 장치 microelectrode 배열 시험관에서 결합 하는 방법을 설명 하는 것을 목표로. 데이터 분석, 즉 탐지 및 전파 하는 활동 전위의 특성은 수행을 사용 하 여 새로운 고급, 아직 사용자 친화적이 고 자유롭게 사용할 수, 계산 도구.

Microelectrode 배열 마이크로 신경 통신 및 Axonal 신호 전파 공부에 대 한 인터페이스

마이크로미터 규모의 3D 프린팅을 통해 신경 세포 배양을 위한 고분자 장치의 신속한 프로토타이핑이 가능합니다. 원리 증명으로, 뉴런 사이의 구조적 연결은 신경돌기 성장에 영향을 미치는 장벽과 채널을 만들어 제한되었으며, 이러한 조작의 기능적 결과는 세포 외 전기 생리학에 의해 관찰되었습니다.

2광자 중합 마이크로 스케일 신경 세포 배양 장치의 3D 프린팅

여기서는 HD-MEA를 사용하여 대규모 신경 앙상블, 특히 해마, 후각 전구 회로 및 인간 신경 네트워크의 계산 역학을 탐구합니다. 계산 도구와 결합된 시공간 활동을 캡처하면 신경 앙상블 복잡성에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이 방법은 뇌 기능에 대한 이해를 높여 잠재적으로 신경 장애에 대한 바이오마커 및 치료법을 식별합니다.

CMOS 통합 고밀도 미세전극 어레이에서 Multimodal Large-Scale Neuronal Ensemble Dynamics 기록 및 분석

이 프로토콜은 in vitro에서 간질을 모델링하기 위해 다중 전극 어레이에 dorsal-ventral fused assembloids를 안정적으로 도금하는 것을 목표로 합니다.

인간 만능 줄기 세포 유래 뇌 조립체를 사용하여 간질을 모델링하기 위한 다중 전극 어레이 플랫폼

학습하세요 3D 신경망을 마이크로 전극 배열(MEA)에 결합하는 혁신적인 체외 실험 모델을 구축하는 방법을. 유리 마이크로비드를 지지체로 활용하여 생리학적으로 더 적절한 환경에서 신경 활동을 연구합니다.

마이크로 전극 배열에 3D 엔지니어링의 연결을 문화의 인터페이스 : 혁신을

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