Метку без Методика пространственно-временных изображений из одной клетки секрета

Общая цель следующего эксперимента заключается в измерении секреции белков отдельными клетками с высоким временным и пространственным разрешением. Это достигается путем литографического изготовления золотых плазмонных наносенсоров на стеклянных покровных стеклах для безмаркерной визуализации секретов единичных клеток. На втором этапе чип-сенсор очищают, покрывают самоорганизующимся монослоем, а затем функционализируют лигандами, обладающими высоким сродством к секретируемым белкам-аналитам.

Затем клетки интегрируют на функционализированные чипы сенсоров для измерения их секреции в пространстве и времени. Результаты показывают, что секрецию белков отдельными клетками можно картировать как пространственно, так и временно без необходимости в маркировке. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области межклеточной коммуникации, например, о том, как паракринные и автокринные сигнальные пути регулируют подвижность клеток.

Для начала данной процедуры методом электронно-лучевого испарения на предварительно очищенные покровные стекла нанесите тонкую хромовую пленку толщиной 10 nanometer, чтобы избежать эффектов зарядки при создании рисунка и получении изображений наноструктур. После этого нанесите первый слой двухслойного резиста, состоящего из сополимера этил-лактата и метилметакрилата, при 2000 RPM в течение 45 секунд. Затем подвергните подложку прогреву при 150 °C, предварительно дав ей остыть до комнатной температуры.

Нанесите второй слой полиметилметакрилата методом центрифугирования при 3000 RPM в течение 45 секунд и запеките подложку при 150 °C. Сформируйте рисунок на двухслойном резисте с помощью электронно-лучевой литографии (EBL). Проявите слой, используя смесь изопропилового спирта (IPA) и метилизобутилкетона (MIBK) в соотношении два к одному, и промойте в IPA.

Удалите хром из области сформированных наноструктур с помощью влажного травления, используя раствор CR seven в течение 10 секунд при комнатной температуре, после чего промойте образец деионизированной дистиллированной водой. Нанесите на подложку пленку титана и золота с помощью электронно-лучевого испарителя, следуя протоколу осаждения золота. Удалите двухслойный сополимерный резист, выдерживая подложку в ацетоне в течение четырех часов.

Затем осмотрите подложку с помощью сканирующего электронного микроскопа, чтобы подтвердить форму и размер наноструктур. Полученные наноструктуры обычно разделены шагом 300 nanometers. Массивы наноструктур размером 20 на 20 расположены с расстоянием 30 microns между центрами.

Для обеспечения достаточного пространства при визуализации клеток типичный чип будет содержать 300 массивов. Удалите остатки хрома с подложки с помощью влажного травления краев, используя раствор CR seven в течение 60 секунд при комнатной температуре. Затем промойте подложку в деионизированной дистиллированной воде.

Затем исследуйте часть массивов с помощью атомно-силового микроскопа для проверки размера и однородности. Это структурированное стеклянное покровное стекло можно использовать многократно при условии соблюдения надлежащих процедур очистки и регенерации чипов локализованного поверхностного плазмонного резонанса (LSPR). Выполните плазменное пепельное очищение при мощности 40 watts в смеси 5% hydrogen и 95% argon в соотношении 300 milli в течение 45 seconds.

Функционализируйте золотую поверхность и наноструктуры сразу после плазменного озоления. Для этого погрузите чип в двухкомпонентный раствор тиолов в этаноле, состоящий из SPO и SPC в соотношении три к одному. После выдержки чипа в растворе тиолов в течение ночи для формирования самоорганизующегося монослоя, промойте его этанолом и высушите потоком азота, затем установите LSPR-чип в специально изготовленный микрофлюидный держатель, поместив его на алюминиевое основание.

Затем поместите чип между этим нижним элементом, силиконовой прокладкой и прозрачной пластиковой верхней частью, закрепив сборку четырьмя винтами. Для типичного применения тиолов на основе SPC нанесите каплей 300 µL смеси 133 мМ EDC и 33 мМ NHS в деионизированной дистиллированной воде в соотношении один к одному для активации карбоксильных групп тиолового компонента SPC. После выдержки в течение 10 минут вручную промойте поверхность 10 мМ PBS, после чего проведите конъюгацию активированной карбоксильной группы с интересующим лигандом, нанеся каплей 300 µL раствора лиганда.

После выдержки в течение одного часа и промывки поверхности 10 мМ PBS, на чип наносят 300 мкл 0,1 М этаноламина в PBS для минимизации неспецифического связывания. По истечении 10 минут этаноламин смывают PBS, содержащим 0,005% Tween 20, или PBST 20. Затем над чипом помещают кварцевый элемент, чтобы уменьшить колебания данных, вызванные изменением мениска.

При установке на микроскоп поддерживайте чип во влажном состоянии, используя буфер PBST 20. Подсоедините микрофлюидные трубки к узлу и пропускайте буфер до достижения стационарного состояния. Затем плотно поместите узел с LSPR-чипом в держатель образцов термостата.

Оптическая схема для данного метода представлена здесь. Свет от галогенной лампы проходит через длинноволновой фильтр с границей пропускания 593 нм для отсечения длин волн, которые не участвуют в наноплазмонном отклике. Затем свет подвергается линейной поляризации, и образец освещается через объектив с увеличением 40x и числовой апертурой 1,4 для возбуждения плазмонных золотых наноструктур.

Рассеянный свет собирается объективом и проходит через скрещенный поляризатор для снижения фонового сигнала от стеклянной подложки. В путь собираемого света вставляется светоделитель 50 50 для одновременного спектроскопического и визуального анализа. После того как установка и микроскоп отстоятся для уравновешивания в течение как минимум двух часов, с помощью джойстика совместите чип таким образом, чтобы центральный массив находился на одной оси с оптоволокном для проведения спектроскопии.

После культивирования и осаждения гибридных клеток DOMA путем центрифугирования соберите их, затем проверьте жизнеспособность перед нанесением на чипы LSPR. После этого вручную нанесите 50 µL клеточной суспензии на чипы LSPR с помощью микропипетки. В завершение удалите оставшиеся в растворе клетки свежей безсывороточной средой, используя микрофлюидную систему перфузии, чтобы подготовить чипы LSPR к визуализации.

Здесь представлено совмещение изображения LSPR-визуализации, на котором выделены квадратные массивы, и изображения при освещении проходящим светом, на котором видна клетка в левом нижнем углу. Клетка, окрашенная флуоресцентным красителем мембран родомина DHPE, имеет нитевидные выросты, напоминающие филоподии. Если бы такие выросты перекрывали массивы, это привело бы к ложноположительным результатам в данных спектрометрии секреции белков. Здесь представлены данные до и после введения насыщающего раствора анти-cmic антител к функционализированным cmic массивам.

Данный метод используется для калибровки массивов. Калибровка массивов помогает нормализовать отклик сенсоров и определить долю занятых сайтов на основе профиля биофункционализации каждого запуска. Для определения константы диссоциации, а также для изучения устойчивости к неспецифическому связыванию используется коммерческий прибор ПРП (SPR) по тому же протоколу, который описан для чипа ЛПРП (LSPR).

Здесь представлены нормализованные значения двух массивов. Один массив находился на расстоянии 10 µm от клетки, в то время как контрольный — на расстоянии 130 µm от клетки. Внезапное увеличение нормализованного отклика массива, расположенного ближе к клетке, по сравнению с плоским откликом контрольного массива свидетельствует о локализованном выбросе секретируемых антител.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как измерять секрецию белков отдельными клетками с высоким пространственным и временным разрешением.