Name: 使用渗透皮下血管紧张素Ⅱ输液泵诱导主动脉瘤小鼠 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 了解使用渗透皮下血管紧张素Ⅱ输液泵在小鼠中诱导主动脉瘤的实验方法。该技术通过持续给药研究主动脉扩张的病理特征和分子机制，为心血管疾病研究提供可靠的动物模型。

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本手稿中所展示的研究工作由美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）资助（资助号：HL107319 资助 Alan Daugherty，HL107326 资助 Lisa A. Cassis）。本手稿中的内容由作者全权负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。本手稿的出版由 DURECT Corporation 赞助。

伦理声明：小鼠实验经肯塔基大学机构动物护理和使用委员会（IACUC 协议编号：2006-0009）批准后进行。实验结束时，采用过量的氯胺酮（~ 210 mg/kg）和赛拉嗪（~ 30 mg/kg）混合物对小鼠实施安乐死。
1. 血管紧张素II含量的计算
注意：本方案以在4只雄性LDL受体-/-小鼠中输注血管紧张素II（AngII，1,000 ng/kg/min）持续4周为例，这些小鼠饲喂富含饱和脂肪的饮食。
<ol>
	<li>在计算输注所需血管紧张素II（AngII）剂量前，先称量实验小鼠的体重。</li>
	<li>使用模板（表1）计算实验所需的AngII质量。在模板的第4步中，“泵送速率”应采用泵说明书上标明的“平均泵送速率”。在模板中手动填写第1至第5步，第6至第10步将自动计算。
	<ol>
		<li>在模板中，假设小鼠在以1,000 ng/kg/min剂量输注AngII持续4周期间，体重增加1 g。 
		注意：每只小鼠的体重增长可能存在显著差异，具体取决于多种变量，如小鼠品系和饮食。我们通常根据以往研究经验，采用“0&#34;”或“1 g”作为预估值。</li>
		<li>每只小鼠配制300 µl的AngII溶液总体积，因为每只泵大约需要250 µl。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

2. AngII 的溶解
<ol>
	<li>将冻干的 AngII 小瓶在 -20 °C 下保存。使用前将 AngII 小瓶平衡至室温（RT）。</li>
	<li>将计算好的 AngII 质量（如表 1所示，7.3 mg）称取至一个无菌塑料管中。 
	注意：根据《默克索引》（Merck Index），请勿使用玻璃管进行溶解，因为 AngII 的水溶液对玻璃具有较强的结合亲和力。</li>
	<li>向含有冻干 AngII 的塑料管中加入计算好的无菌生理盐水体积（1,200 µl），盖上管盖，并通过反复倒置充分混匀，直至溶液澄清。</li>
	<li>在单独的带盖无菌塑料管（0.5 - 1.5 ml）上标记小鼠编号 #1、#2、#3 和 #4。根据步骤 1.2 和表 1中计算出的体重，分别在超净台中为每只小鼠配制 AngII 溶液。
	<ol>
		<li>例如，向 1 号管中加入 3.6 µl 无菌生理盐水，然后加入 296.4 µl AngII 溶液，通过轻柔地上下吹打充分混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在带盖塑料管（4 ml；无菌）上标记小鼠编号。这些试管将用于孵育泵，具体操作见步骤 3.13。</li>
</ol>
3. 渗透泵填充
<ol>
	<li>获取泵的两个独立部件：泵主体和流量调节器（图1）。每个包装盒内含10个泵主体和流量调节器，均单独包装。记录批号。 
	注意：操作时务必佩戴手套，因为手上的油脂转移到泵外壳会影响泵的功能。准备泵时应使用无菌手套、纱布、试管、灌注针和称量舟，以避免植入时发生感染风险。</li>
	<li>仅打开实验所需数量的泵主体和流量调节器，因为一旦打开便无法再次储存。若所需泵数量超过10个，应确保同一实验中所有泵的批号一致，因为不同批号的泵其平均填充体积和泵送速率可能不同。</li>
	<li>分别称量每个泵（包括泵主体和流量调节器），并记录至小数点后四位（例如，小鼠#1为1.1443 g）。该重量在模板中称为“空泵重量”（表1），用于计算填充率。</li>
	<li>将泵灌注针连接至1 cc无菌注射器，并从编号正确的塑料管中小心吸取AngII溶液。注意避免吸入空气。</li>
	<li>将针头朝下，仔细排除注射器中的所有气泡。保持针头/注射器朝下位置，防止气泡进入泵内。</li>
	<li>轻轻将灌注针插入泵主体，将针尖推进泵内。切勿使针尖紧贴泵底部。</li>
	<li>缓慢推动注射器活塞，向泵内注入AngII溶液。泵内出现的深色阴影表示填充液面。根据说明书，填充体积约为246 µl。</li>
	<li>当液体从泵口溢出形成液滴时，立即停止填充，并小心拔出针头。</li>
	<li>通过泵主体顶部的孔将流量调节器插入泵内，直至流量调节器头部与泵主体顶部之间无任何间隙（图1）。</li>
	<li>将调节器插入泵主体时，会有少量液体从流量调节器开口处渗出。请小心吸去在安装过程中可能泄漏的所有多余液体。</li>
	<li>称量已填充的泵。在模板中“填充后泵重量”一栏记录该重量。</li>
	<li>计算填充率（%）=（“填充后泵重量” - “空泵重量”）× 1,000 / 平均填充体积 × 100。
	<ol>
		<li>按照表1所示方法计算填充率。理想情况下，填充率应等于或大于100%。若填充率&#60; 95%，则需重新填充（提示泵内可能存在气泡）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将填充好的泵放入已标记的4 ml试管（步骤2.5）中，调节器头部朝上。加入足量无菌生理盐水完全浸没泵。在植入前将泵保存于生理盐水试管中。</li>
	<li>将试管置于37 ºC培养箱中。过夜孵育（至少12小时），以实现部分预启动，随后植入小鼠体内。AngII的泵送作用约在植入后24小时开始，以便小鼠在AngII输注引起潜在应激前完成术后恢复。</li>
</ol>
4. 泵植入前的准备
<ol>
	<li>至少在手术前1天，将纱布、棉签以及手术器械（包括剪刀、止血钳、镊子、缝合钉和缝合器）在重力模式下进行干热灭菌（15分钟）。</li>
	<li>在操作室内，使用异氟烷准备麻醉用挥发器。在层流罩内打开无菌铺巾，并放置用于异氟烷麻醉的鼻罩。将聚维酮碘、70%乙醇、无菌水、干热灭菌珠、消毒洗手液、棉签、纱布和装满液体的注射泵置于层流罩内。</li>
	<li>戴上口罩和手术服，然后用清洁的手在层流罩内打开外层铺巾。戴上无菌手套，打开无菌内包装。</li>
</ol>
5. 泵植入手术操作
<ol>
	<li>将小鼠放入诱导室，通入流速为1.5 - 2%的异氟烷。小鼠倒伏后继续监测2 - 3分钟。在小鼠左侧或右侧肩部剃毛，剃毛区域约为硬币大小。</li>
	<li>将小鼠置于层流罩内，使其鼻部紧贴连接异氟烷流出装置的鼻锥（图2A）。将小鼠头部朝向术者惯用手一侧。使用兽用眼膏涂抹小鼠眼睛，防止麻醉期间角膜干燥。手术前需确认小鼠对疼痛刺激无反应，例如足底反射是判断疼痛反应的良好指标。</li>
	<li>用聚维酮碘擦拭剃毛区域，随后用70%乙醇擦拭三次。&#160; 佩戴或更换无菌手套。</li>
	<li>使用手术刀在前肢肩胛骨后方耳后处做一条约1 cm的切口，切口方向应与尾部垂直。注意仅切开皮肤，避免损伤皮下组织。</li>
	<li>一手持镊子撑开切口，另一手持止血钳在皮下分离，建立皮下隧道（图2B）。</li>
	<li>将止血钳尖端朝尾部方向推进，创建用于放置泵体的皮下囊腔。操作时需小心张开止血钳钳口，在皮下撑开一个袋状空间，随后将止血钳从切口退出。</li>
	<li>将泵体插入切口，使调节头朝向小鼠尾部（图2C）。轻柔地将泵体完全推入囊腔内。确保留有足够空间，以便无张力地闭合伤口，避免皮肤牵拉。</li>
	<li>泵体植入后，用力捏合切口两侧，使切口边缘对齐，然后使用1至2个伤口夹闭合切口（图2D）。检查切口部位，确保伤口完全闭合，且泵体未直接压迫切口。</li>
	<li>使用干净的棉签涂抹局部利多卡因乳膏（4% wt/wt）。将小鼠从鼻锥移开，置于加热垫上直至恢复意识。苏醒后将小鼠放回笼中。</li>
	<li>每只小鼠操作间隔，将手术器械放入玻璃珠灭菌器中灭菌10秒。待器械冷却后再使用。每只小鼠操作间用抗菌手消毒液清洁手套。持续监测所有小鼠，直至完全恢复。</li>
	<li>术后密切观察小鼠状态。若小鼠出现痛苦、脱水或明显体重下降的迹象，应皮下注射生理盐水（0.2 - 0.3 ml）。术后前10天每天至少观察两次，之后每天至少观察一次。若小鼠在AngII输注期间死亡，应立即进行尸检。术后7 - 14天拆除伤口夹。</li>
</ol>
6. 主动脉的收获、固定、清洗与成像
<ol>
	<li>从腹侧切开小鼠胸腔和腹腔，剪开右心房，通过左心室灌注生理盐水以清除主动脉中的血液，然后取下主动脉27。</li>
	<li>将取下的主动脉置于含有至少3 ml 4%多聚甲醛或10%中性缓冲福尔马林的塑料管中，固定24–48小时27。</li>
	<li>小心去除外膜组织。用大头针将主动脉固定在黑色蜡板上。使用相同的放大倍数采集主动脉图像。每张图像中均需包含标尺以用于校准，如图3所示。</li>
</ol>
7. 主动脉的切面成像
<ol>
	<li>沿主动脉弓的外侧和内侧弯曲处纵向切开主动脉，并切开主要分支，包括无名动脉、左颈总动脉和左锁骨下动脉。将主动脉平铺，外膜侧紧贴黑色蜡板固定。</li>
	<li>以相同放大倍数获取主动脉内膜表面的正面图像。每张图像中均需包含标尺以供校准，如图4所示。</li>
</ol>

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<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+receptor-associated+protein+attenuates+angiotensin+II-induced+atherosclerosis+in+hypercholesterolemic+mice+without+influencing+abdominal+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Deficiency of receptor-associated protein attenuates angiotensin II-induced atherosclerosis in hypercholesterolemic mice without influencing abdominal aortic aneurysms.</a> Atherosclerosis. 220 (2), 375-380 (2011).</li>
<li>Daugherty, A., Rateri, D., Lu, H., Balakrishnan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+blood+pressure+in+mice+using+volume+pressure+recording%2C+a+tail-cuff+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring blood pressure in mice using volume pressure recording, a tail-cuff method.</a> J Vis Exp. (27), e1291(2009).</li>
</ol>

本文的出版由 Alzet 赞助。

皮下植入可释放血管紧张素II（AngII）的渗透泵是诱导小鼠主动脉瘤的常规方法。根据多家实验室的研究数据，该方法被一致认为是研究小鼠腹主动脉瘤（AAA）3,4 和胸主动脉瘤（TAA）22-26的一种可靠且可重复的手段。因此，该小鼠模型被认为能够重现人类主动脉瘤的多种特征，并为深入理解这些严重疾病的发病机制提供重要线索。
尽管衰老是人类腹主动脉瘤（AAA）的危险因素，但在小鼠中，衰老对血管紧张素II（AngII）诱导的AAA尚未进行系统研究。然而，已有证据表明，在8至48周龄的小鼠中，AngII诱导的AAA发生率和严重程度相似4,5,7。&#160; 目前仅有少数研究报道了8至24周龄小鼠中AngII诱导的胸主动脉瘤（TAA）22-26，这些研究未发现TAA形成存在明显的年龄相关差异。
与输注血管紧张素II（AngII）的雄性小鼠相比，雌性小鼠发生腹主动脉瘤（AAA）的频率显著更低4,28。此外，值得注意的是，在高胆固醇血症小鼠中，AngII诱导的AAA发生率远高于正常胆固醇血症小鼠，前者超过50%，而后者低于30%。此外，在正常和高胆固醇血症小鼠中，输注AngII期间主动脉破裂的发生较为常见（约10–30%）。在高胆固醇血症小鼠（如喂食西方饮食的LDL受体-/-小鼠或喂食正常或西方饮食的载脂蛋白（apoE）-/-小鼠）中，以1,000 ng/kg/min速率输注AngII对AAA的形成具有最大效应3,4,29。该输注速率适用于研究在高胆固醇血症小鼠中调控目标基因以期减少AAA发生的情况。如果预期在高胆固醇血症小鼠中进行的干预会加重AAA，则建议以500 ng/kg/min或更低的速率输注AngII30。与AAA不同，目前尚无证据表明雄性性别或高胆固醇血症与AngII诱导的胸主动脉瘤（TAA）之间存在关联25。然而，与AAA类似，如果预期对目标基因的干预会加重TAA，我们建议采用低于1,000 ng/kg/min的AngII输注速率。
还需要注意的是，AngII诱导的主动脉瘤在不同小鼠个体之间以及不同研究之间，其发生率和严重程度存在差异。如果小鼠未出现主动脉瘤，一种可能的原因是AngII未能成功递送至小鼠体内。为了验证AngII的高输注速率（例如1,000 ng/kg/min），建议在AngII输注前及输注期间，采用无创尾套法测量血压31。以1,000 ng/kg/min速率输注AngII可升高小鼠的收缩压。此外，由于AngII对肾素分泌具有负反馈作用，因此可在AngII输注期间或实验终点检测血浆肾素浓度。AngII输注会导致血浆肾素浓度降低。如果接受AngII输注的小鼠未表现出明显的主动脉病理变化，且血压无升高、血浆肾素浓度无下降，则提示AngII可能未通过植入的渗透压微型泵有效递送。建议将此类小鼠从研究中剔除。还需注意的是，部分小鼠尽管收缩压升高且血浆肾素浓度降低，但仍不发生主动脉瘤，这类小鼠应保留在研究中。
综上所述，通过皮下植入渗透压泵输注血管紧张素II（AngII），可在小鼠中诱导主动脉瘤的形成。该方法能够以设定的速率持续递送AngII，并维持指定的时间，用于研究腹主动脉瘤（AAA）和胸主动脉瘤（TAA）。

主动脉瘤表现为主动脉管腔的永久性扩张，具有破裂风险，通常导致死亡。该疾病可发生于腹主动脉和胸主动脉区域，分别称作腹主动脉瘤（AAAs）和胸主动脉瘤（TAAs）。由于对分子机制和病理生理过程的理解尚不充分，目前尚无经证实的药物疗法能够预防任一类型主动脉瘤的扩张或破裂。由于难以获取患者样本且无法直接在人体中进行实验，有关AAAs发病机制的研究常常依赖于动物模型的推断。一种常用的动物模型是将血管紧张素II（AngII）皮下输注至小鼠体内。与其他诱导小鼠AAAs的手术方法相比，例如需经剖腹术进行的主动脉内灌注弹性蛋白酶或主动脉周围应用氯化钙的方法1,2，该方法无需进入体腔，且对手术技术要求较低3,4。
最初报道通过渗透泵皮下输注血管紧张素II（AngII）以诱导腹主动脉瘤（AAA），是在喂食富含饱和脂肪饮食的低密度脂蛋白（LDL）受体 -/- 小鼠中实现的3，随后在喂食普通实验室饮食的apoE -/- 小鼠中也得到证实4。近年来许多研究还表明，AngII可在血脂正常的小鼠中诱导AAA形成5-7。输注AngII的方法已被广泛用于诱导AAA，并用于探索其分子机制以及潜在治疗策略的开发（例如，&#160;5-15），因为该模型重现了人类AAA中观察到的多种特征。例如，人类AAA的危险因素（如吸烟、衰老和男性性别）也会增强小鼠中AngII诱导的AAA16,17。高胆固醇血症与人类AAA之间的关联尚需进一步阐明；然而，在小鼠中，高胆固醇血症增强AngII诱导的AAA已得到一致证实18。小鼠中AngII诱导的AAA病理表现具有高度异质性，其特征为显著的巨噬细胞浸润、胶原降解、血栓形成与溶解以及新生血管形成19-21。与人类AAA最常见发生于肾下腹主动脉不同，小鼠中AngII诱导的AAA主要发生于肾上主动脉区域。AngII诱导的AAA另一普遍特征是透壁性中膜破裂，导致透壁性血栓形成。目前尚不清楚人类是否发生透壁性弹力蛋白断裂，因为缺乏早期动脉瘤组织，人类AAA的病理发展过程尚未得到系统研究。
将AngII注入小鼠体内也会导致胸主动脉区域显著扩张，这种扩张主要局限于升主动脉，而升主动脉正是人类胸主动脉瘤（TAAs）最常见的发生部位19,22-26。与AngII诱导的腹主动脉瘤（AAAs）类似，AngII诱导的胸主动脉瘤也重现了人类胸主动脉瘤的多种特征25。然而，与AngII诱导的腹主动脉瘤不同的是，AngII诱导的胸主动脉瘤并不伴随高胆固醇血症，且无性别差异。
皮下输注血管紧张素II（AngII）至小鼠体内的总体目标是研究腹主动脉瘤（AAA）和胸主动脉瘤（TAA）的病理特征及分子机制。

<table><tbody><tr><td>血管紧张素II</td><td>Bachem</td><td>H-1705</td><td>用于诱导主动脉瘤的化合物</td></tr><tr><td>Alzet渗透泵</td><td>DURECT Corporation</td><td>Alzet Model 2004</td><td>适用于体重&gt; 20 g的小鼠进行28天输注</td></tr><tr><td>高饱和脂肪饮食</td><td>Harlan Teklad</td><td>TD.88137</td><td>提供42%热量/热量，用于在LDL受体-/-小鼠中诱导高胆固醇血症</td></tr></tbody></table>

利用渗透泵进行皮下血管紧张素ii输注在小鼠中诱导主动脉瘤

Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice

渗透泵可将化合物以恒定速率持续输送到小型动物体内。本文介绍了一种通过植入式渗透泵皮下输注血管紧张素II（AngII）诱导主动脉瘤的标准实验方案。该方案包括AngII用量计算与溶解、渗透泵填充、渗透泵皮下植入、植入后观察以及小鼠主动脉取材以观察主动脉瘤形成。按照本方案通过渗透泵进行AngII皮下输注，是一种可靠且可重复诱导小鼠腹主动脉瘤和胸主动脉瘤的技术。根据研究目的不同，输注时间可从数天至数月不等。在载脂蛋白E缺陷或低密度脂蛋白受体缺陷等高胆固醇血症雄性小鼠模型中，AngII输注剂量为1,000 ng/kg/min时，足以对腹主动脉瘤形成产生最大效应。通过渗透泵输注AngII诱导的腹主动脉瘤，在高胆固醇血症雌性小鼠中的发生率比雄性低5至10倍，且在胆固醇水平正常的两性小鼠中发生率均较低。相反，AngII诱导的小鼠胸主动脉瘤则不受高胆固醇血症或性别的影响。重要的是，该小鼠模型的多个特征可很好地模拟人类主动脉瘤的病理特点。

方案部分所述的4只雄性LDL受体-/-小鼠在输注AngII 4周后被实施安乐死。取出主动脉，清洗并成像以观察主动脉扩张情况。如图3所示，主动脉表现出多种不同特征，包括肾上腺上区域扩张（腹主动脉瘤，AAAs；图3A）、升主动脉区域扩张（胸主动脉瘤，TAAs；图3B）或两个区域均扩张（同时存在AAAs和TAAs；图3C），而一只小鼠的主动脉形态基本正常（图3D）。腹主动脉的扩张程度通过测量肾上腺上区域的ex vivo最大宽度进行量化，如图3A中红线所示。为测量升主动脉扩张程度，将主动脉打开并固定，如图4所示。在升主动脉区域测量内膜表面积（图4A中红线包围的区域）以定量TAAs。每张图像中均包含标尺，以便标准化测量，如图3和图4所示。
<img alt="色谱系统中的流速调节器，带标注的示意图，展示流体控制组件。" src="/files/ftp_upload/53191/53191fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 典型的充满式渗透泵图像。每个泵包含两个独立部分：主体和流速调节器。将 AngII 注入泵体后，插入流速调节器以密封泵体。
<img alt="小鼠手术步骤，包括麻醉、手术器械和术后护理。" src="/files/ftp_upload/53191/53191fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 泵植入手术过程。（A）将小鼠置于层流罩内，通过鼻罩持续吸入异氟烷和氧气；（B）用直型止血钳插入皮肤切口，建立皮下隧道；（C）将泵经皮肤切口轻柔插入；（D）泵植入后，用皮肤缝合钉闭合切口。
<img alt="解剖示意图；AAA 和 TAA 动脉切片；解剖学比较；血管研究" src="/files/ftp_upload/53191/53191fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 输注 AngII 的小鼠主动脉图像（ex vivo）。 在雄性 LDL 受体 -/- 小鼠中以 AngII 1,000 ng/kg/min 的速率持续输注 28 天。(A) 伴有血栓形成的腹主动脉瘤（AAA）；红色线（2.05 mm）表示肾上主动脉区域最大主动脉宽度的测量值。(B) 升主动脉扩张（TAA），腹主动脉外观正常；(C) 升主动脉和肾上主动脉区域均出现显著扩张（TAA 和 AAA）；(D) 外观正常的主动脉，升主动脉和肾上主动脉区域均无明显扩张。
<img alt="神经再生实验：带有比例尺参考并用A-D标记的分段神经组织。" src="/files/ftp_upload/53191/53191fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 输注AngII的小鼠胸主动脉区域的正面成像。 雄性LDL受体-/-小鼠持续输注AngII（1,000 ng/kg/min），为期28天。红色线条勾勒出的表面积代表升主动脉区域，包括部分主动脉弓。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="2">所需剂量</td>
			<td></td>
			<td>1,000</td>
			<td colspan="2">ng/kg/min</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="3">起始体重（最大小鼠）</td>
			<td>24.8</td>
			<td>g</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td colspan="3">预计总体重增加量</td>
			<td>1</td>
			<td>g</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>输注速率</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.25</td>
			<td>µl/hr</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td colspan="2">小鼠数量</td>
			<td></td>
			<td>4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">每只动物每小时给药剂量</td>
			<td></td>
			<td>1518</td>
			<td>ng</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>所需浓度</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6072</td>
			<td>ng/μl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td colspan="2">配制300 μl溶液</td>
			<td></td>
			<td>1.82</td>
			<td colspan="2">mg/300 μl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">所需溶液</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td colspan="2">总AngII量（mg）</td>
			<td></td>
			<td>7.3</td>
			<td>mg </td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td colspan="2">溶于生理盐水</td>
			<td></td>
			<td>1,200</td>
			<td>μl </td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>小鼠编号</td>
			<td>体重</td>
			<td>稀释因子</td>
			<td colspan="2">体积（μl）</td>
			<td colspan="2">泵重量（g）</td>
			<td>填充比例</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#</td>
			<td>(g)</td>
			<td></td>
			<td>AngII</td>
			<td>生理盐水</td>
			<td>空泵</td>
			<td>注满后</td>
			<td>(%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>24.5</td>
			<td>1.0</td>
			<td>296.4</td>
			<td>3.6</td>
			<td>1.1443</td>
			<td>1.3877</td>
			<td>99</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>23.0</td>
			<td>0.9</td>
			<td>278.2</td>
			<td>21.8</td>
			<td>1.1677</td>
			<td>1.4145</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>24.8</td>
			<td>1.0</td>
			<td>300.0</td>
			<td>0.0</td>
			<td>1.1438</td>
			<td>1.3904</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>21.8</td>
			<td>0.9</td>
			<td>263.7</td>
			<td>36.3</td>
			<td>1.1438</td>
			<td>1.3904</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="7">稀释因子 = 小鼠体重 / 最大小鼠体重</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>小鼠</td>
			<td>体重</td>
			<td>稀释因子</td>
			<td colspan="2">体积 (μl)</td>
			<td colspan="2">泵重量 (g)</td>
			<td>填充率</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#</td>
			<td>(g)</td>
			<td></td>
			<td>AngII</td>
			<td>生理盐水</td>
			<td>空泵</td>
			<td>填充后</td>
			<td>(%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>24.5</td>
			<td>1.0</td>
			<td>296.4</td>
			<td>3.6</td>
			<td>1.1443</td>
			<td>1.3877</td>
			<td>99</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>23.0</td>
			<td>0.9</td>
			<td>278.2</td>
			<td>21.8</td>
			<td>1.1677</td>
			<td>1.4145</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>24.8</td>
			<td>1.0</td>
			<td>300.0</td>
			<td>0.0</td>
			<td>1.1438</td>
			<td>1.3904</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>21.8</td>
			<td>0.9</td>
			<td>263.7</td>
			<td>36.3</td>
			<td>1.1438</td>
			<td>1.3904</td>
			<td>100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：通过渗透泵进行28天输注的计算。

皮下植入渗透泵为化合物的长期且稳定的递送提供了一种便捷的方法。该方法已广泛用于研究小鼠的腹主动脉瘤和胸主动脉瘤。

利用渗透泵进行皮下血管紧张素II输注在小鼠中诱导主动脉瘤

渗透泵可将化合物以恒定速率持续输送到小型动物体内。本文介绍了一种用于诱导主动脉...的标准实验方案。

本实验的总体目标是研究小鼠主动脉瘤的病理特征及分子机制。首先，制备含有血管紧张素II溶液的渗透泵。随后，在动物背部皮肤上制作一个皮下囊袋，并将渗透泵植入其中。最终，可通过离体成像评估胸主动脉和腹主动脉区域的主动脉扩张情况。我们首先采用该技术，是因为在输注血管紧张素以促进动脉粥样硬化发展时，我们迫切希望明确血压所起的作用。演示该操作过程的是Soha心血管研究中心成员Deborah Hart和Angio banan。为填充渗透泵，首先记录泵和流量调节器的批号，这些部件随泵主机和流量装置一同提供。操作时应佩戴手套，避免将手上的油脂沾染到泵的外壳表面。接着，仅打开本研究所需的泵和流量调节器数量。然后称量每个泵的重量，包括主体和流量调节器，记录至小数点后四位。该重量在模板中称为空泵重量，将在所有泵称重后用于计算填充比例。将泵填充针连接至一支无菌的1 cc注射器，并从相应编号的塑料管中小心吸取新配制的血管紧张素II溶液，填充注射器。将注射器针头朝下，小心地排出所有气泡。然后保持注射器此朝向，以防止气泡进入泵内。轻柔地将填充针插入泵体中。当针头就位后，将针尖推进泵内，直至刚好接触泵的底部。然后缓慢按压推杆，注入约 246 µL 的溶液。泵内出现的深色阴影可用于监测填充液位。泵已充满。当有液滴从泵中溢出时，小心拔出针头，并将流速调节器从泵体顶部的孔插入泵内，直至流速调节器头部与泵体顶部之间无间隙为止。插入过程中若有多余液体渗出，需小心吸干。然后称量装满的泵，并在模板中相应的泵、装满重量单元格中记录重量。随后可使用公式计算填充率，并将该数据输入模板中的填充率单元格。理想情况下，填充率应等于或大于95%。当泵填充完毕后，将其放入适当的无菌4毫升塑料管中，确保调节头朝上，并加入足量的无菌生理盐水以完全覆盖泵体。然后，当所有泵都存放好后，将导管置于37摄氏度培养箱中至少12小时，以便在植入当天对泵进行部分预启动。穿戴防护服、口罩和手套后，对麻醉小鼠肩部约硬币大小的区域进行剃毛，并将动物转移至超净工作台。在动物眼睛上涂抹眼膏，确认其对脚趾夹捏无反应后，用碘伏擦拭剃毛区域，随后用70%乙醇擦拭三次。接下来，使用经高压灭菌的外科手术刀片，在前肢肩胛骨上方耳后处的皮肤上，垂直于尾巴方向做一条一厘米长的切口。然后用一只手持镊子，另一只手持止血钳撑开切口，并在皮下组织中用止血钳尖端向尾巴方向分离，形成一个皮下隧道。小心打开止血钳的钳口，为泵创建一个囊袋。然后用相应的泵替换止血钳，将调节头朝向小鼠后部，并轻柔地将泵完全推入皮下 pocket。应留有足够的空间，以便无张力地闭合伤口，避免皮肤拉伸。将泵放置到位后，用力夹紧并拉直切口两侧，使切口边缘对齐，并用一到两个伤口夹闭合皮肤。检查切口部位，确保伤口完全闭合，且泵未直接压迫切口。然后使用干净的棉签将局部利多卡因乳膏涂抹于该区域。最后，将小鼠转移至加热垫上，直至其恢复意识，然后将动物放回笼中。在本实验中，经过四周的血管紧张素泵输注（泵的植入方法如前所述），从低密度脂蛋白受体敲除小鼠中获取主动脉，以观察其主动脉扩张情况。如图所示，这些主动脉表现出多种不同特征，包括肾上腺上区的扩张、升主动脉区的扩张，或两个区域均出现扩张，其中一只小鼠则表现出明显正常的形态。随后通过测量离体状态下肾上腺区域的最大宽度来量化腹主动脉扩张程度，如红线所示，用于测量升主动脉的扩张。然后将主动脉打开并按图示固定。使用每幅图像中的标尺测量升主动脉区域的内膜表面积，本图及后续图像中均包含标尺，以确保测量的标准化，此操作经熟练掌握后进行。每个样本的此操作步骤不应超过五分钟。

subcutaneous-angiotensin-ii-infusion-using-osmotic-pumps-induces

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

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