Name: マイクロポストアレイ上の簡単かつ正確なメカノプロファイリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 学ぶマイクロポストアレイを用いた単一細胞のメカノバイオロジー解析法。標準的な光学顕微鏡とMechProfilerソフトウェアで細胞と基質間の力学的相互作用を可視化し、がん細胞の転移メカニズム研究に応用できる。

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この作業は、Committee Technology and Innovation (CTI) Switzerland grant 14796-PFLS-LSCTIの支援を受けました。MicroPostアレイは、MicroDuits GmbHによって寛大に提供されました。

マイクロポストアレイ上の1細胞を培養します注：すべての手順は、無菌性を確保するために、バイオセーフティキャビネット内で実行する必要があります。ここで指定したボリュームは、T25細胞培養フラスコのためのものです。細胞培養培地レシピ及び細胞播種密度は、骨癌細胞株HuO9およびM132のために最適化されます。 <ol><li>マイクロポストアレイ上に播種するための細胞培養を準備します。 <ol><li>標準光顕微鏡で培養フラスコを配置することによって、細胞培養の品質を検査します。細胞がカバーされているどのくらいの培養フラスコの底部の推定し、典型的な成長と形態を示していることを確認してください。 70％-80％のカバレッジが健全な成長率を反映しています。彼らは死んだ細胞および/または過成長文化を表すとして、浮遊細胞の量に注意してください。 </li><li> 4ミリリットル1×リン酸を含む培地と洗浄を除去することにより、トリプシン処理細胞を、生理食塩水（PBS）のバッファをバッファリング。 0.8ミリリットル1×トリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を追加し、セルまで室温でインキュベートSは約2〜4分をとる、取り除きます。顕微鏡でプロセスを確認し、時折脱落をサポートするために、静かにフラスコをタップします。 </li><li> 5 mlの細胞培養培地（ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％ウシ胎児血清（FBSと/ F12）、1％ペニシリン/ストレプトアビジン（ペニシリン/ストレプトマイシン））反応を停止し、じっと座って残留細胞を洗浄するための追加フラスコの底に。その後、均一な混合物を得るために上下に数回この懸濁液をピペット。効果的な脱落を得るために、フラスコの元の成長分野全体のすべてのソリューションをピペッティングすることを確認します。 </li><li> 15mlチューブに細胞懸濁液を移し、3分間0.5×gでテーブルトップ遠心分離器を使用して遠心します。 </li><li>上清を除去し、ピペッティングによって、および5回上下5 mlの培地中で細胞ペレットを再懸濁。そうすることながら、気泡の発生を回避することを確認します。 </li><li>細胞計数チャンバと光microscoを使用して、細胞密度を決定しますPE。細胞集合体のための細胞計数チャンバー内の細胞懸濁液を確認し、その後の実験のために、単一の細胞を持っていることを確認します。ピペット再び数回上下細胞は、それらを分離するために凝集体を形成する傾向がある場合。 </li><li> 25,000細胞/ mlの細胞溶液を得るために十分な培地で細胞懸濁液を希釈します。閉じたチューブを数回反転させてそれをよく混ぜます。 </li></ol></li><li>細胞播種のためのマイクロポストの配列を準備します。 クリティカル注：これは、潜在的に不要な気泡が導入されている場合は特に、マイクロポストに害を及ぼす可能性があるので、直接マイクロポストアレイ上にピペットしないでください。また、発生する毛管力はマイクロポストの崩壊につながるとして、マイクロポストの配列が乾燥することはありませんことを確認してください。 <ol><li>ピンセットを用いて、12ウェルプレートのウェルに表向きにし、1 mlのエタノール（99％）を加えることにより、それを湿らマイクロポストのアレイを有するガラス基板を配置します。 20〜30秒間、室温でインキュベートします。 </li><li>希エタノールウェル側に約1 mlの滅菌脱イオン水（DI水）を添加し、トランスファーピペットまたは吸引装置を用いて、およそ1 mlで吸引することにより、段階的。このステップを少なくとも3回繰り返します。 </li><li>約1mlを添加し、吸引することにより、同様にPBS緩衝液で脱イオン水を交換してください。このステップを3回繰り返します。 </li><li>追加し、約1mlの培地を吸引することにより、媒体とPBS緩衝液を交換してください。このステップを3回繰り返します。 </li></ol></li><li>各準備マイクロポストの配列の上にピペット1ミリリットルの細胞溶液（25,000細胞）。クローズマルチウェルプレートインキュベーター（5％CO 2、37℃）に移します。細胞が付着し、6 -7時間、マイクロポストの上に成長しましょう​​。 </li><li>光学顕微鏡を用いて、時折接着プロセスを検査します。細胞のほとんどは、複数のマイクロポストにまたがって表示されていることを確認してください。 </li></ol> 2.細胞を固定＆染色注：すべてのステップとここで指定したボリュームは、12ウェルプレートの1ウェルのためのものです。これは、マイクロポストの崩壊につながるであろう、任意の液体を吸引した後、ウェルの乾燥を避けるために、一度に12のウェルの4以上ないを処理することをお勧めします。 <ol><li>ウェルから培地を吸引し、洗浄細胞を1 mlのPBSバッファーで2倍。インキュベーション中にマイクロポストアレイ上に蓄積された細胞破片を除去し、死細胞を分離するために、PBSで洗浄しながら緩やかな力を適用することを確認します。 </li><li> 5分間0.5ミリリットル3.7％緩衝ホルムアルデヒド溶液で細胞を固定してください。 </li><li> 1ミリリットルの滅菌DI水でマイクロポストアレイ2回洗浄することにより、ホルムアルデヒド溶液を交換してください。 </li><li>約90秒間（50％水、40％エタノールおよび10％酢酸中0.05％クマシーブリリアントブルー）染料で細胞を染色します。 1ミリリットルの滅菌脱イオン水で2回オフ余分な染色液を洗います。配列をマイクロポストする1ミリリットルのDI水を追加します。 </li><li>光顕微鏡を用いて染色結果を確認してください。繰り返しトン細胞体を可視化するにはあまりにもかすかであるならば、彼は、ステップを染色します。 </li><li> 4℃の冷蔵庫内で上に染色された細胞を用いた店舗マイクロポストアレイ。すべての回で水の下でそれらを保つために確認してください。 </li></ol> 3.細胞イメージング注：ステップ4は、無限遠補正された光学顕微鏡なしに適用されます。 <ol><li>高分解能イメージングのための薄いガラス底部を有するペトリ皿に2ミリリットルの脱イオン水を追加します。 </li><li>マイクロポストを上に向けてイメージング皿にピンセットを使用して、マイクロポストのアレイを転送します。 </li><li>光学顕微鏡の可動ステージ上の画像ペトリ皿を置きます。 </li><li>スケールの数は、ガラス基板、シリコーンエラストマーと上に液体の屈折率の不整合を補償するための光路に沿ってすべての材料の厚さの合計を表しまで、イメージングのために使用されるレンズの補正リングを回します。これは、マイクロポストの明るい外観につながるはずコア。 </li><li>ダウン50％への照明側の絞りを閉じ、通常の明視野モードを有効光路から任意の位相差リングを取り外します。 </li><li>マイクロポストは、観察視野を横切って水平線を形成するマイクロポストの配列の位置を合わせます。開始点（例えば、左上）を定義し、多数の画像を撮影しながら、マイクロポストの配列を走査し、ステージ全体でペトリ皿を段階的に移動します。 </li><li> 20Xや40X対物レンズを使用してカメラの最高解像度が設定されたすべての画像を取ります。画像の中央に1つのセルを持つことを目指しています。 </li><li>マイクロポストの先端が焦点になるまで基板を介してz軸に沿ってスイープ。顕微鏡の微調整フォーカスホイールを使用し、約2〜3ミクロンのためのマイクロポストの底に焦点を当てた方にそれを回します。 </li><li>露光時間、例えば、（一度に一つのパラメータの撮像を掃引する1つの配列セクションのテスト一連の画像を撮影することにより、標準的なイメージング手順を確立し、）、ランプ等の設定を設定するアイリス。 MechProfilerで画像を分析し、高速で信頼性の高い分析に適したパラメータセットを決定します。 </li></ol>オープンソースソフトウェア「MechProfiler「4.画像解析注：すべてのソフトウェア機能は、マウスの左ボタンを使用して、ポインティングデバイスを用いて活性化することができます。しかし、訓練を受けたオペレータは、効率的な両手の画像処理を可能にするために、キーボードの左半分になるように設計、文書化のショートカットキーを使用します。 <ol><li>画像解析ソフトウェアMechProfilerを起動し、「開く」をクリックして分析する必要がある画像の範囲を開きます。 </li><li>ソフトウェア開発者によって与えられた「設定」セクションにすべてのパラメータを挿入します。カスタムソフトウェアのマニュアルにより詳細に記載された手順に従って（ すなわち、輪郭しきい値と最小距離）に設定する必要があるパラメータを決定します。 </li><li>画像を分析一つ一つ「クロップ」を使用して関心領域にそれらをトリミングすることによって（マウスボタンをクリックしてドラッグを押下）です。このアクションを完了するために描かれた長方形の内側をダブルクリックします。 </li><li> 「セルの枠線の描画」とセルが接続されているすべてのマイクロポストを含む描画に十字カーソルを使用をクリックすることで、それぞれの可視セルのアウトライン一つ一つをマーク。 </li><li> 「廃棄投稿」をクリックすることにより、不要なマイクロポストを破棄し、描画するための十字カーソルを使用しています。画像セクションの外のセルに属しているか、それは他の理由ではなく、目的の細胞によって偏向されているすべてのマイクロポストを囲みます。 </li><li>マウスクリックにより「重心を探す「ソフトウェアサブルーチンを起動します。右横に中央に赤い×印で表示されているすべてのマイクロポストが登録されるまで、「重心を検索」ボタンへのフィルタ設定を調整します。フィルタ設定が低すぎると、それは高すぎるムーであればマイクロポストは、無視されますltiple位置は、単一のマイクロポストのためにマークされます。分析セッションの間に一定のフィルタ設定をしてください。 </li><li>複数または逃したマイクロポストの位置に重心のマニュアル編集機能「手動編集」を使用してください。クリックして、それを越えてドラッグすることで、問題のマイクロポストを選択するために、マウスの十字線を使用してください。長方形の内側をダブルクリックして、自動的に閉じ拡大画像]セクションに不足している赤いマーカーを配置します。それが描かれたセルの輪郭の外側にある場合は先に進む前に、（ステップ4.5を参照）、このようなマイクロポストを捨てます。 </li><li>マウスクリックで「グリッドの生成」機能を活性化することにより、理想的なマイクロポストのグリッドを検索します。位置が描かれたセルアウトラインの内側、青いリングによって示される、真のマイクロポストのヘッドに対応することを確認してください。 </li><li>マウスクリックで対応する「マヌエル編集」機能を使用して、必要に応じ、セル領域内の任意の見当違いのグリッドメーカーを修正してください。クにマイクロポストを選択するために十字を使用して、クリックして、それを越えてドラッグしestion。登場する四角形の内側をダブルクリックして、自動的に閉じ拡大画像]セクションに不足している青色のマーカーを配置します。 </li><li>画像部と、生成された理想的なグリッド内部のマイクロポストの位置との差に基づいて算出された偏差値のヒストグラムを取得するためにクリックしマウスでボタン「計算たわみ &quot;を使用してください。 </li><li> 「保存」をマウスでクリックすることにより、値のテーブルを含む完全な分析を保存します。 </li><li> 「表示をリセット」と「次の画像」上の他の画像部分やマウスのクリックを分析し、便利な右のキーボードのカーソルキーを使用して行うことができるをクリックすることで、どちらかの画像解析を続行します。 </li></ol> 5.データ分析 - Mechanoprofiling <ol><li>分析画像をフォルダからオフィススプレッドシートプログラムでファイル &quot;results.xls」を開きます。それはアルとのデータが含まれていますlは分析された細胞によってすべてのマイクロポストのたわみや、仕事などの標準的な微分措置を含む値（ すなわち、基板の変形エネルギー）を算出しました。 </li></ol>

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</ol>

筆頭著者 (NG) は、この研究で使用されたマイクロポスト アレイの商業サプライヤーである MicroDuits GmbH の共同創設者です。他の著者は、この作品と潜在的な利益相反を持っていません。

この作品は、実質的にエントリへの技術的、実用的な障壁を下げることによって牽引力顕微鏡の分野を進めることを目指しています。これらの障壁は、二つの側面から来ます。まず第一に再現可能に製造し、実験的にマイクロポストの配列を委託するために克服しなければならない多数の非自明な技術的課題があります。典型的な実験は、細胞の数百または数千もの分析を必要とするかもしれないことを念頭において - 第二に、単一細胞の力の信頼性の半自動分析のため、同様に非自明な必要性です。上記の技術は、常駐エンジニアリングの専門知識を持っていない細胞生物学研究所内のマイクロポストベースの牽引力顕微鏡にアクセスできるように開発されました。この記事で紹介したセンサーや分析技術は、非専門家が容易にかつ正確に、単一細胞によって及ぼされる力を分析できるようにする必要があります。 別に細胞生物学のLへのアクセスから少なくとも半ばグレード明視野顕微鏡でABは、記載の方法は、いくつかの追加の技術要素を必要とします。ここでは、ほとんどのユーザーは、技術のパワーと汎用性にもかかわらず、あっても限られた経験を持つ有効な牽引力顕微...

メカノ敏感な細胞ベースのアッセイは、メカニックが細胞生物学でプレーすることができます中心的な役割を反映して、幅広いアプリケーションで、接着細胞を調査することを可能にします。これらのアプリケーションは、多くの場合、細胞内プロセスまたは全細胞の挙動を駆動機序に焦点を当てています。一方、このような細胞外マトリックス組成物またはマトリックスの剛性などの外部環境要因が劇的に細胞の機械的および生物学的応答に影響を与えることができる。1同様の薬学的に活性な化合物の多くのクラスの使用後に観察することが可能である効果がそれらの多くの場合、細胞培養モデルを用いて特徴づけ、そのような自発的または実験的に誘導され、遺伝子の突然変異によって引き起こされるもののような一方の遺伝子型の性質上2を 、細胞骨格の構造および機能の変化と関連している細胞の表現型の著しい変化を誘導することができる。3これらの実施例は、あります多くの可能なのほんの一部トピックれる細胞の機械的な表現型が関連しており、これらの全てが有用マイクロポストのアレイで検討されています。 この記事の執筆時点では、約200の記事は、細胞マイクロポストの相互作用を記述する公開されています。これらの作品は、マイクロポスト偏向原則の理論的側面だけでなく、その製造上の実際的な手順について説明します。細胞や柔軟なマイクロポストアレイの相互作用を記述した最初の記事は、連続する軟質基板はnanonewton規模細胞収縮、タンらを推定するために使用されている古典的な牽引力顕微鏡（TFM）とは対照的に、2003年4タンらによって発表されました。シリコーンエラストマー製の複数の近接した垂直方向のビームを使用する方法を記載しています。この技術の主な利点は、2つの主要な特徴から出てきます。維持しつつ、第1セル見かけ基板の剛性を変更するために、1つは、マイクロポストの寸法を変更する必要がありますそれ以外の場合は一定のため、表面トポロジーと化学の違いを回避基質組成物。第二マイクロポストは、離散的に個々の焦点接着のために力と空間分解能で分析することができ、標準的なTFMにより類似の分析に固有の分析の課題を減らすことができ、個々のバネのように作用します。 今日マイクロポストアレイの適用範囲が大幅にいくつかの単一細胞のための力のほんのマッピングを超えています。たとえば、秋山は、昆虫の筋肉のパワーで動く自律マイクロロボットを開発するために、マイクロポストアレイ用アクチュエータとして蛾の毛虫から分離された背側の血管組織の使用を報告している。5 しかし、マイクロポストのほとんど公開された出願は、感染症や癌のような医学的状態の研究に焦点を当てています。例えば、マイクロポストアレイは、ナイセリアgonorrhのバンドルIV型線毛の力発生を研究するために使用されています感染を増強するシグナルカスケードに関連しているOEAコロニー6その他の細胞骨格を標的とする医薬化合物で処理された乳癌細胞を研究するためにマイクロポストを使用している。7 マイクロポストのたわみは、多くの場合、細胞のみをマイクロポストの非常に先端に取り付けられていると仮定すると、エンド負荷のカンチレバーのための古典的なビーム理論を用いて説明します。たわみδが発生する 。ここで適用される力 F は、マイクロポストの「曲げ剛性」Kに依存して計算され： <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq1.jpg" /> （1） Eと、I、およびLは、ヤング率が、それぞれ慣性ビーム長の面積モーメントです。ビームは剪断および曲げだけでなく、基板の反りがACに入れないので、この式の結果は、仕事だけで力の一般的な近似を与えますカウント。マイクロポストは、典型的には、ポリジメチルシロキサン（PDMS）のような軟質材料から作られていることを考慮すると、シリコーンゴムをベースこれらの要因が含まれる必要があります。 。シェーンらは、マイクロポストのアスペクト比（L / D）と、対応するポリマーのポアソン比 Vに基づいて、そのような補正係数があることを実証した8これは、で与えられます。 <img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq2.jpg" /> （2） T チルト（v）は 、同じ記事で見つけることができるようにフィッティングパラメータa = 1.3が含まれて傾斜係数であることで： <img alt="式3" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq3.jpg" /> （3） それがマイクロポストの補正後の剛性 k CORRは、純粋な曲げ剛性 k = k個の曲がり補正係数CORRの製品であることを意味しますで与えられます： <img alt="式（4）" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq4.jpg" /> （4） したがって、細胞力の計​​算は、現在読んで、式（1）の、より洗練された変化を使用して実行されるべきです。 <img alt="式（5）" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq5.jpg" /> （5） 補正の影響はすぐにマイクロポストの大きさの標準値が使用されているように、より明白になります。例えば、円形の断面とPDMSベースのシリコーンゴム製の5ミクロンの直径15ミクロン、長マイクロポストは、0.77の補正係数をもたらし、したがって、未補正の計算は、23％によって及ぼされる細胞力を過大評価するであろう。これは、より小さなアスペクト比を有するマイクロポストのためにさらに深刻になります。 伝統的には、マイクロポストの画像分析は、理想的なビーム曲げ理論に基づいています。 2005年にMICRの使用を開拓グループOPOSTアレイは、マイクロポスト解析に適した画像解析ソフトウェアを発表した9ソフトウェアは、ソフトウェアライセンスを必要とし、ユーザーはそれぞれの位置のための3つの画像を取る必要があります。送信モードと染色された細胞で蛍光モードで別の1でマイクロポストの上部と下部の平面から一つずつ。それぞれに上部と下部の位置を比較した後、ソフトウェアが力のベクトル場を決定し、ポストあたりの力のような関連パラメータを計算するマイクロポスト。他のソフトウェア・パッケージが存在し、彼らの分析の原則を簡単にそれらを記述し、対応する記事に記載されているが、これらの解析ソフトウェアパッケージは、一般公開されていません。10,11 マッピングセル力のために設計されマイクロポストのアレイは、全ての隣接マイクロポストの間に等距離ギャップの利点を有する後者の直交マイクロポストのレイアウトや六角形一つであることのいずれかに分類することができます。典型的なマイクロポストヘクタール円形断面をまし、それらの寸法は、長さ50μmの直径及び2に1.0ミクロンから10ミクロンの範囲にある。4しかし、楕円形または正方形の断面を有するマイクロポストも報告されている。12,13 マイクロポスト材料としてPDMSベースのシリコーン混合物の使用は、混合物中にナノ粒子を添加することが可能になります。例えばコバルトナノロッドを追加すると、マイクロポストの磁気活性化を可能にし、したがって、潜在的な実験デザインに別の自由度を与える。14ほとんどのグループは、カバーガラスのような、またはペトリ皿の内側のフラットリジッド基板上でのマイクロポストアレイを生成します。しかし、マンと共同研究者は最近、伸縮性膜上に形成されたマイクロポストの配列を報告した。15これは、細胞収縮性の点で生細胞の細胞内の動的応答を勉強しながら、セルのアプリケーションは接着細胞に力を伸ばしことができます。 広く使用されている最もESTABSU8フォトレジストを用いてシリコンウエハの上に微細構造を生成するために使用される短い標準クリーンルーム工程においてシニァデツキら。16-18の洞察に満ちたプロトコールに記載されているようにマイクロポストのアレイを作製するためのプロセスがlishedソフトリソグラフィーに基づくものです。これは、シリコーンゴムを金型にそれらを移送構造体上にキャストされたコピー処理が続きます。第二段階では、これらの型は、選択された基板の上にシリコンゴムを使用して初期の微細構造を複製するために使用されます。しかし、彼らのアプリケーションに関連する出版物の大規模で増えているにもかかわらず、マイクロポストの製造プロセスを確立することはあっても、マイクロエンジニアリングの専門家のためにかなりの時間がかかります。許容可能な品質レベルを得るために、特定のラボ環境とマイクロポストレイアウトに最適化と適応を必要とする多くの処理工程があります。 市販のマイクロポストアレイは準備ができて-Tで使用できるようになりました一貫して高品質のO-使用（「既製」）形式。そのため彼らは、オンサイト生産に必要な複雑かつ長時間の製造プロセスに代わるもの。この論文では、市販のマイクロポストのアレイは、単一の明視野顕微鏡画像を用いて、細胞の力をマッピングするために使用しました。さらに重要なのは、この資料では、この原稿の副教材としてダウンロードすることができますMechProfilerという名前のフル機能のオープンソース・ソフトウェアを、説明し、文書化します。ソフトウェアの活発にメンテナンスバージョンもhttp://www.orthobiomech.ethz.chで見つけることができます。 「既製」アッセイと互換性のあるオープンソースの解析ソフトウェアの組み合わせは、著しく正確なTFM実験を達成するために、エントリハードルを下げます。クリーンルーム施設やソフトウェア開発の専門知識のいずれかを利用できない研究者が成功した細胞の力を分析することができます。これはmechanosに注力することを可能にensitivityアッセイ出力ではなく、技術そのもの、およびより広範な地域社会への牽引力の測定値を利用できるようになります。さらに、これはマイクロポストアレイの完全自動スクリーニングへの道を切り開くための重要なステップです。 MechProfiler解析ソフトウェアは、ファイル形式、TIFF、PNG、BMPおよびJPGの画像を処理します。画像は、蛍光、位相差または明視野光学顕微鏡を用いて撮影することができます。スタンドアロンのプログラムは、（で入手できます： 図12）は、フリーのMatlabのコンパイラのランタイムと一緒に実行され、基礎となるアルゴリズムは、約1分で、単一または複数のセルで画像を処理することを可能にする、合理化された画像処理を可能にします。さらに、これらの細胞を、生きてもよいし、「固定」。 MechProfilerソフトウェアが大きく品質の商用マイクロポストのアレイの再現性に依存することにより、データ分析のスループットを増加させることができ、より具体的には、デフォルト・＃8220;配列内の各ポストの非偏向」位置が理想的なグリッドに対して推定することができる（この研究のために使用される配列内のグリッドの製造偏差は100nm未満でした）。 短いものでは、関心領域にそれらの作物、分析のための画像ファイルの選択を開き、細胞で覆われたポストを定義するか、廃棄する必要がある、ポスト位置を決定し、偏向/理想格子に対する力を計算し、最終的に標準的なオフィスのスプレッドシートに含め、輸出の可能性を持つすべてのセル固有のデータを保存します。

<table><tbody><tr><td>T25細胞培養フラスコ</td><td>Nunc</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>1x PBSバッファー</td><td></td><td>Sigma D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.5% トリプシン-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>中型 DMEM/F12</td><td>Sigma</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>FBS South America</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン 100x</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>15 ml遠心分離機バイアル</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲンI/フィブロネクチン</td><td>MicroDuits</td><td>MPA-col1/FN</td>でプレコートされたマイクロ<td>ポストアレイ マイクロポスト寸法: &Oslash;=6.4&#160;&マイクロ;m、l = 18.2 &micro;m;グリッド=13 &micro;m, kcorr=2.87&#160;nN/&micro;m</td></tr><tr><td>エタノールABS p.A.</td><td>メルク</td><td>100.983</td><td></td></tr><tr><td>12 ウェル プレート</td><td>Nunc</td><td>150628</td><td></td></tr><tr><td>ホルマリン溶液、中性緩衝 10%</td><td>シグマ</td><td>HT5011</td><td></td></tr><tr><td>ブリリアント ブルー G-250</td><td>シグマ</td><td>27815</td><td>クーマシー</td></tr><tr><td>ブルー メタノール ACS p.A.</td><td>メルク</td><td>1.06009</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>シグマ</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底皿</td><td>WillCoウェルズBV</td><td>GWSb-3522</td><td>35 mm直径、開口部22&nbsp;mm</td></tr><tr><td>T-100 エクリプス</td><td>ニコン</td><td>n/a</td><td>倒立顕微鏡</td></tr><tr><td>D3-L3</td><td>ニコン</td><td>n/a</td><td>カメラコントローラー</td></tr><tr><td>DS Fi2</td><td>ニコン</td><td></td><td>カメラ</td></tr></tbody></table>

マイクロポストアレイ上の簡単かつ正確なメカノプロファイリング

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

細胞培養基質は、統合された柔軟なマイクロポストにより、ユーザーは細胞とその周辺との間の機械的相互作用を研究することができます。特に、細胞と基質の相互作用が主な関心事です。今日、マイクロポストアレイは、過去10年間に発表された幅広いアプリケーションを備えた、十分に特性評価され確立された方法です。しかし、マイクロポストの製造には長く困難なプロセスがあり、マイクロポストと相互作用する細胞の画像を解析するための簡単にアクセスできるソフトウェアがないため、生物学者の間ではこの技術を適応させることに躊躇しているようです。
マイクロポストからの力の読み出しは驚くほど簡単です。マイクロポストは、セルがその先端に理想的に取り付けられたバネのように機能します。細胞は、サイズに応じて、その細胞骨格から1つまたは複数の焦点接着点を介してマイクロポストに力を加え、マイクロポストを偏向させます。たわみの量は、方向と大きさに加えられる力に直接相関します。細胞が覆うマイクロポストの数とポストの偏向パターンは特徴的であり、ポストあたりの力などの値や、細胞表現型の「メカノプロファイリング」を可能にする多くの生物学的に関連するパラメータの決定を可能にします。
ここでは、すぐに使用できる市販のマイクロポストの第一世代と、現在すべての研究者がアクセスできる社内開発のソフトウェアパッケージを組み合わせた、メカノプロファイリングの便利な方法について説明しています。典型的なアプリケーションのデモンストレーションとして、骨がん細胞の単一画像を明視野顕微鏡で撮影し、転移の細胞株モデルのメカノプロファイリングを行いました。この商用牽引力センサーと解析用のオープンソースソフトウェアの組み合わせにより、専門家でないユーザーが行う日常的なラボ作業にマイクロポストアレイ技術を迅速に実装することが初めて可能になりました。さらに、堅牢で合理化された解析プロセスにより、ユーザーは大量のマイクロポスト画像を非常に時間効率の良い方法で解析することができます。

記載された技術の主な利点は、通常の実験室の作業に迅速かつ効果的な統合のためのシンプルさと可能性にあります。オープンソースソフトウェアと対になって高品質の商用センサアレイの組み合わせは、そうでなければ、クリーンルーム施設や画像解析やソフトウェア開発についての深い知識へのアクセスを必要とするであろう。 図1は、提示された方法のワークフローを示してメカノ感度に関する情報を提供します。これは、マイクロポストアレイ上に細胞を調製し、播種から始まります。細胞を固定し、染色した後、マイクロポストアレイは、イメージングのための準備ができています。技術の中心部はMechProfilerソフトウェアを用いた画像解析です。ユーザーがすぐにGUIの「設定」に関連するすべてのパラメータを入力した後に画像をanalyszng開始することができます。対応する画素のサイズは単一のピクセルによって表される、ユーザの設定に依存されている長さです。それは必要既知のサイズの対象物の画像を撮影して、各使用拡大のために別々に確立することができます。例は補足図9に示されています。 <p class="jov...

は、接着細胞と微細構造基質との間の機械的相互作用を定量化するためのプロトコルです。これらの相互作用は、遊走、増殖、分化、アポトーシスなどの重要な細胞挙動と密接に関連しています。このプロトコルには、MechProfilerと呼ばれるオープンソースの画像解析ソフトウェアが用意されており、各マイクロポストの関与する力を決定できます。

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

本手法の目的は、標準的な光学顕微鏡を用いて細胞と基質の特有な相互作用から生じる力を可視化することにより、単離した単一細胞からメカノバイオロジー的に関連する特性を収集することです。提示された手法はメカノバイオロジーにおけるプラットフォーム技術であり、がん細胞の転移における細胞収縮の役割など、がん研究における重要な疑問の解明に寄与します。この手法の主な利点は、ほとんどトレーニングを受けていないユーザーでも、神経生物学的な情報を堅牢に抽出できることです。また、標準的な光学顕微鏡と互換性があり、ハイスループット処理に適しています。第三に、この方法はヒト骨癌細胞のメカノバイオロジー的な特性に関する知見を提供します。本手法は、平滑筋細胞や心筋細胞などの自動細胞型にも適用可能です。まず、マイクロポストアレイが上を向くようにガラス基板を12ウェルプレートのウェル内に配置します。基板が浸るように、1 mLの99%エタノールをウェル内に間接的に加えます。液体操作の各ステップで気泡が形成されていないこと、およびマイクロポストアレイが常に薄い液層で覆われていることを確認してください。その後、アレイを室温で20〜30秒間インキュベートし、ウェルの側面に滅菌脱イオン水を1 mL加えます。エタノール吸引液と混合したら、ウェルからエタノール溶液を約1 mL吸引し、さらに脱イオン水を1 mL加えます。この工程を少なくとも3回繰り返し、サンプルを濡らします。次に、同様の方法で、ウェル内の脱イオン水をPBSに置換します。約1 mLずつ添加し、吸引する操作を3回繰り返してください。その後、同じ手順を用いてPBSを培地に置換します。アレイが約1 mLの培地で満たされたら、1 mLの培地に懸濁した25,000個の標的細胞を、マイクロポストアレイが準備されたウェルにピペットで分注します。次にマルチウェルプレートを閉じ、37°C、5% CO2のインキュベーターに移します。細胞がマイクロポストの上に接着して増殖するまで6〜7時間置き、接着過程を確認します。適宜、光学顕微鏡を使用してウェルから培地を吸引し、1 mLのPBSで細胞を2回洗浄します。PBSで洗浄する際は、インキュベーション中にマイクロポストアレイに蓄積した細胞残渣を除去し、死細胞を剥離させるため、緩やかな力を加えるようにしてください。次に、細胞を固定するため、3.7%緩衝ホルムアルデヒド溶液0.5 millilitersを加え、5分間静置します。その後、ホルムアルデヒド溶液を除去し、1 milliliterの滅菌脱イオン水を用いてマイクロポストアレイを2回洗浄します。各洗浄において、固定した細胞を50%water、40%ethanol、10%acetic acidで調製した0.05%kumasi brilliant blue染料で約90秒間覆い、

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

このビデオでは、我々は細胞の収縮性の変調を評価するための微細加工後のアレイ検出器を（mPADs）の製造と利用する方法を示しています。...

微細加工後のアレイ検出器（mPADs）：機械的な力を単離するためのアプローチ

このプロトコルでは、我々は技術がベースとなっている垂直方向に変位の記事のマイクロアクチュエータアレイの製作、そしてどのようにこの基盤技術は2次元と3次元の両方の文化の中でハイスループット機械的にダイナミックな細胞培養を実施するように変更することができますを示していますパラダイム。...

機械的にダイナミックな細胞培養のための微細加工プラットフォーム

オンチップ光重合技術を用いた高分子マイクロアレイの形成の説明。原子間力顕微鏡、水接触角の測定値を使用して高スループット表面特性、飛行二次イオン質量分析法と細胞接着アッセイのX線光電子分光法と時間も記載されている。...

バイオマテリアルのハイスループット検出用高分子マイクロアレイ

この資料では、詳細多重ニードルベースの​​センサの構築を。デバイスは、迅速かつ選択的に複数の分析物のin...

多重経皮電気化学センシングのための中空マイクロニードルベースの​​センサ

細胞機能上の微小環境の分子組成の影響についての洞察を得るためのコンビナトリアル機能的スクリーニング方法が記載されている。この方法は、細胞接着および機能解析をサポートしていることを定義したコンビナトリアル微小環境の配列を生成するために、既存のマイクロアレイベースの技術を活用しています。...

微小環境マイクロアレイの作製と利用（MEArrays）

この原稿は、高コストの複雑な設備を必要とせず凹マイクロウェルの作成の堅牢なメソッドを紹介します。磁気力、スチール ビーズ、貫通穴の配列を使用して、いくつかの百マイクロウェルは 3 cm × 3 cm ポリジメチルシロキサン (PDMS)...

ペアになっているビーズと磁石配列変数の凹面形状とマイクロウェルを成形

巨視的サンプルを使用すると電気的および熱的効果を電気的に補助された変形（EAD）に分離することは非常に困難である。ジュール加熱なしでの形成に及ぼす印加電流の影響およびこれらの試料上の転位の進化を評価するために、カスタム試験手順とともに金属サンプルのマイクロおよびナノ構造が開発されている。...

のための新しい方法<em&gt;現場で</em&gt;ナノスケール試料の電気機械的特性

広域走査型プローブ ナノリソグラフィ プローブ アレイの反復的な配置として細胞表面の相互作用研究のためのリソグラフィー...

広域走査型プローブ ナノリソグラフィ自動配置と細胞培養研究用基板作製への応用

この資料は、物理と化学の高スループット操作キューが模倣した生体内で細胞微小と多重化人工細胞微小環境 (MACME) 配列を準備する詳細な方法についてを説明します単一セルのプロファイリングとひと多能性幹細胞 (hPSCs)...

多重の人工細胞の微小環境配列の作製

ここでは、メカノノード細孔センシング(mechano-NPS)と呼ばれるエレクトロニクスベースのマイクロ流体プラットフォームを使用して、単一細胞を機械的に表現型化する方法を示します。このプラットフォームは、細胞の弾性と粘性の両方の生物物理学的特性を測定しながら、1〜10細胞/秒の中程度のスループットを維持します。...

メカノノードポアセンシング:マルチパラメータシングルセル粘弾性測定のための迅速でラベルフリーのプラットフォーム

ナノスケールの分解能による大規模なサンプル検査は、特にナノ加工された半導体ウェーハにおいて、幅広い用途があります。原子間力顕微鏡は、この目的のための優れたツールとなり得ますが、イメージング速度によって制限されます。本研究では、AFMに並列アクティブカンチレバーアレイを採用し、ハイスループットかつ大規模な検査を可能にしています。...

クワトロパラレルカンチレバーアレイを用いたアクティブプローブ原子間力顕微鏡によるハイスループット大規模サンプル検査(英語)

学ぶマイクロポストアレイを用いた単一細胞のメカノバイオロジー解析法。標準的な光学顕微鏡とMechProfilerソフトウェアで細胞と基質間の力学的相互作用を可視化し、がん細胞の転移メカニズム研究に応用できる。

マイクロポストアレイ上の簡単かつ正確なメカノプロファイリング

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