비례 형광 현미경으로 Phagosome 산도 측정

이 실험 세트의 전반적인 목표는 비율 미터법 형광 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 phaco somal pH를 측정하는 것입니다. 이 방법은 병원체 상호 작용의 핵심 분자 식별 또는 유전적 파괴 또는 약물이 식세포작용에 미치는 영향과 같은 식세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 사실 또는 분광학 효과와 같은 집단 기반 방법과 달리 입자 결합 이동의 변화 또는 개별 phagosome의 이질성을 감지할 수

이 기술의 의미는 병원성 화학 유기체에 대한 우리의 치료법으로 확장되는데, 이러한 미생물 중 다수가 식체 내의 산만함을 피하기 위해 프라고소 pH를 변경할 수 있기 때문입니다. 이 절차를 시작하려면 멸균 PBS 와류 10ml에 건조 Xan 20mg을 추가하고 끓는 물 수조에서 10분 동안 가열합니다. 그런 다음 2000Gs에서 5분 동안 식히고 원심분리합니다.

그 후, 상층액을 제거하고 Xan을 PBS 1ml에 다시 현탁시킵니다. 수조에서 10분 동안 초음파 처리합니다. 그런 다음 Sonicate는 500 마이크로 리터의 재현 탁유 Xan을 2 개의 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 11, 000 Gs에서 5 분 동안 원심 분리합니다.

500마이크로리터의 PBS로 세척을 반복합니다. 그런 다음 pH 9.3에서 갓 준비한 0.1 몰 탄산나트륨 용액 500마이크로리터에 Xan을 두 번 세척하고 최종 세척 후 탄산나트륨 용액 490마이크로리터에 재현탁합니다. 그런 다음 밀리리터당 10밀리그램으로 DMSO에 용해된 10마이크로리터의 FZ를 Xan 와류에 추가합니다.

호일로 덮고 실온에서 4시간 동안 교반으로 배양하여 바인딩되지 않은 눈을 제거하려면 먼저 0.5ml의 DMSO와 150마이크로리터의 PBS로 세척하고 세척 단계 사이의 초음파 처리를 포함합니다. 다음으로 0.5 밀리리터의 DMSO와 300 마이크로 리터의 PBS로 세척 한 다음 0.5 밀리리터의 DMSO와 450 마이크로 리터의 PBS로 세척 한 다음 PBS 단독으로 세척합니다. 그 후, 500 마이크로 리터의 PBS 및 와류에 1 마이크로 리터의 Xan을 첨가하십시오.

그런 다음 10마이크로리터의 희석된 xma 모래를 혈세포 분석기 챔버의 가장자리에 추가하고, 20 x 대물렌즈가 장착된 명시야 현미경에 혈액 세포분석기를 커버 슬립 마운트합니다. 16개의 사각형이 포함된 왼쪽 상단 모서리에 초점을 맞추고 이 영역의 모든 크리스마스 모래 입자를 계산합니다. 핸드 집계 카운터를 사용하여 오른쪽 하단 모서리에 있는 절차를 반복합니다.

그런 다음 다음 방정식을 사용하여 Xan 농도를 계산합니다. 다음으로, 1 대 100 희석 와류에서 광견병에 걸린 항 Xan 항체로 표지된 Xan을 opsonize하고 섭씨 37도의 수조에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. 그 후, 혈구 분석기를 사용하여 크리스마스 모래를 계산 한 다음 100 곱하기 10으로 희석하여 밀리리터 당 6 번째 입자를 계산합니다.

1차 마우스 호중구를 분리한 후 35mm 유리 바닥 접시의 중앙에 호중구의 5번째 호중구에 10의 2배를 추가합니다. 그런 다음 50마이크로리터의 배지를 첨가하여 방울을 펴고 섭씨 37도에서 5분 동안 배양하여 세포가 부착되도록 합니다. 그 후, 골수성 과산화효소 억제제가 함유된 HBSS 1ml를 섭씨 37도로 따뜻하게 합니다.

섭씨 37도의 가열 시스템과 40 x 오일 대물렌즈가 장착된 광시야 형광 현미경에 접시를 장착합니다. 세포와 장비가 평형을 이룰 수 있도록 10분 동안 이미징 없이 세포를 배양합니다. 다음으로, 30초마다 440나노미터 또는 490나노미터 여기 및 535나노미터 방출로 명시야 투과 이미지를 획득하도록 현미경 설정을 조정합니다.

2분 후, 접시 중앙에 있는 6개의 피지 zy 모래에 10 곱하기 10을 넣고 30분 동안 이미징을 계속합니다. 30분 후 타임랩스 획득을 중지하고 타이머를 시작합니다. 스테이지를 이동하고 다양한 시야에서 10개 이상의 스냅샷을 캡처하여 5분 이내에 다른 vaga 영역을 이미지화할 수 있습니다.

이 절차에서는 교정 용액을 해동하고 수조에서 섭씨 37도까지 가열합니다. pH 측정기로 pH를 확인하고 기록하십시오. 다음으로, 이미지를 획득하기 전에 유리 바닥 접시에 연동 펌프를 장착합니다.

그런 다음 30분의 획득 기간이 끝날 때 실시간 비디오 현미경을 수행합니다. 펌프를 켜서 접시에 있는 용액을 제거하십시오. 그런 다음 첫 번째 교정 용액 1ml를 추가하고 펌프를 중지합니다.

신호가 안정될 때까지 5분 동안 기다립니다. 각 보정 용액에 대해 절차를 반복합니다. 타임랩스 무비와 식체 스냅샷을 분석하려면 이미지 J가 있는 이미지를 엽니다.셀이 없는 영역에 작은 정사각형 ROI를 그려 490 채널의 배경을 뺍니다.

정사각형 다각형 선택 도구를 사용하고 플러그인을 클릭합니다. 그런 다음 나중에 BG 빼기. 편집을 클릭하여 440 채널에서 동일한 ROI를 업로드합니다.

그런 다음 선택 후 선택 복원을 수행하고 배경 빼기 절차를 반복합니다. 첫 번째 클릭 프로세스로 490 채널의 32비트 비율 이미지를 440 채널로 나눈 이미지를 만듭니다. 그런 다음 이미지 계산기.

그런 다음 이미지 1 및 이미지 2 드롭다운 메뉴에서 적절한 이미지를 선택합니다. 작업 드롭다운 메뉴에서 나누기를 선택하고 32비트 결과 확인란을 선택합니다. 그런 다음 이미지를 클릭하여 색상 코딩 조회 테이블을 비율 호환 색상 코딩으로 변경한 다음 테이블을 위로 변경합니다.

그런 다음 무지개 RGB. 이미지를 클릭하여 0 픽셀과 무한대 픽셀을 제거할 비율 이미지의 임계값을 설정합니다. 그런 다음 임계값을 조정한 다음 조정합니다.

Xan이 빨간색으로 표시되도록 스크롤 막대를 조정하고 적용을 클릭한 다음 배경 픽셀을 nan으로 설정 확인란이 선택되어 있는지 확인합니다. 배경 및 Xan 신호 값이 매우 유사한 비율 값을 생성하여 잡음이 있는 비율 이미지가 생성되는 경우 프로세스를 클릭하여 440 채널에 소량의 배경을 다시 추가합니다. 그 다음은 수학입니다.

그런 다음 비율 이미지를 추가한 다음 다시 만들어 더 깨끗한 결과를 얻습니다. 또는 440채널 배경 빼기를 생략합니다. 다음으로, 이미지 색상을 클릭하여 이 비율 스택을 명시야 채널과 다중 채널 합성으로 결합합니다.

그런 다음 채널을 병합합니다. 회색 채널 드롭다운 메뉴에서 명시야 이미지를 선택하고 녹색 채널 드롭다운 메뉴에서 비율 이미지를 선택합니다. 그런 다음 소스 이미지 유지 확인란을 선택합니다.

그런 다음 명시야와 비율 채널을 비교하는 타임랩스 동영상 또는 스냅샷을 스캔하여 분석할 식체를 결정하고, 타원형 다각형 선택 도구를 사용하여 식체체 주위에 ROI를 그리고, 분석 도구를 클릭하여 ROI 관리자에 추가합니다. 그런 다음 ROI 관리자를 추가한 다음 추가 다중 측정을 클릭하여 Xan 강도 비율을 측정하고 슬라이스당 한 행 확인란을 선택 취소합니다. 타임랩스 동영상의 경우.

FGA 영역은 ROI 유형 컨트롤 M을 그려 한 번에 하나씩 추적하여 각 시점을 측정하고 시간 경과에 따른 강도 값을 추적하기 위해 필요할 때 ROI를 이동합니다. 그런 다음 결과 창의 측정값을 스프레드시트에 복사하여 형광을 pH 값으로 변환합니다. 스프레드시트의 보정 타임랩스 동영상에서 식체에 대한 490-440 비율을 측정한 후 시간 경과에 따른 비율 값을 플롯합니다.

그런 다음 각 pH 보정 용액에 해당하는 기간 중간의 5개 시점에서 시야 내의 모든 식체에 대한 평균 비율 값을 계산합니다. 최소 3개의 독립적인 보정을 단일 그래프로 결합하여 실제 측정된 pH에 대해 이러한 평균 490 - 440 비율 값을 표시합니다. 그런 다음 비선형 회귀 분석을 수행하여 비율 값을 pH로 변환하는 방정식을 얻습니다.

이 그림은 식체(phagosome)와 섭취된 Xan이 어떻게 구별되는지 보여줍니다. 왼쪽 패널에는 병합된 명시야 이미지와 490 - 440 Fitz zy 및 비율이 표시됩니다. 반면 오른쪽 패널에는 명시야 이미지만 표시됩니다.

식체는 세포와 공동 국소화하지 않거나 형광이 표시된 명시야 이미지에서 식체의 특징인 더 밝은 고리로 둘러싸인 어두운 중심과 일치하지 않는 외부 입자와 구별할 수 있습니다. 다음은 야생형 및 HV CN one knockout 호중구 FGA 오말 pH, 야생형 호중구의 pH, pH의 neu 중성 또는 경알칼리성 섭취 후 HV CN one knockout 호중구의 식체는 알칼리성 또는 산성 컴파일일 수 있습니다. 표적 추가 후 30-35분 후에 촬영한 스냅샷을 통해 여기에 표시된 Fitz Xan 비율의 히스토그램에 있는 많은 수의 식체에서 평균 집단 smal pH를 계산할 수 있습니다.

야생형과 HVCN one knockout 호중구 사이의 smal pH 차이를 볼 수 있습니다.이 기술을 마스터하면 6시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 최적화 단계부터 시작하여 이미징 조건을 최적화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 첫째, 최적화 단계를 위해 항체 농도를 최적화하는 것도 이 절차에 따라 강력한 식세포작용을 보장하는 데 도움이 될 수 있습니다.

로스 생성 측정 또는 박테리아 사멸 측정과 같은 다른 방법은 스멀 로스 또는 박테리아를 죽이는 파고솜의 능력이 발달 후 pH와 함께 변경되는지 여부와 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다. 이 기술은 식세포 생물학 분야의 연구자들이 식세포 세포가 섭취한 물질을 죽이거나 처리하여 추가 면역 반응을 유도하는 능력에 영향을 미치는 요인을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 살아있는 세포에서 식체의 생리학적 매개변수를 실시간으로 측정하기 위해 기하학적 형광 현미경 검사를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

UNIFOR 억제제 및 살아있는 세포를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.