Name: Iniciando A diferenciação em células multipotentes imortalizadas Otic progenitoras (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Aprenda a diferenciar células progenitoras oticas multipotentes imortalizadas em tipos celulares do ouvido interno. Este método in vitro auxilia pesquisas sobre regeneração auditiva e desenvolvimento de células ciliadas cocleares.

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O trabalho foi apoiado em parte pelo Duncan and Nancy MacMillan Faculty Development Chair Endowment Fund (K.Y.K.), Busch Biomedical Research Grant (K.Y.K.) e Rutgers Faculty Development Grant (K.Y.K.).

1. Manter a auto-renovação em células IMOP <ol><li> Prepare IMOP meios de cultura: DMEM / F12, suplemento B27 1X, 25 ug / ml e carbenecillin 20 ng / ml de bFGF. Adicione 50 ml de meio de cultura IMOP utilizando reagentes estéreis. Aquecer-se 49 ml de DMEM / F12 numa cónico de 50 ml num banho de água a 37 C °. <ol><li> Descongelar 50X suplemento B27 e 100 mg / ml carbenecillin alíquotas, esterilizadas por filtração para 5 min num banho de água a 37 ° C. Descongelar a 100 ug / ml de bFGF aliquota à TA. Adicionar 1 ml de 50X B27, 10 ul de 100 ug / ml de bFGF e 12,5 uL de 100 mg / ml em DMEM carbenecillin / F12. </li></ol></li><li> Use 3 ml de mídia em uma placa de 60 mm de cultura de tecidos para as células de cultura IMOP. Adicionar meio fresco às culturas a cada dois dias, dobrando o volume de mídia. Certifique-se de que a concentração de bFGF não cai abaixo de 5 ng / ml. <ol><li> IMOP células de cultura a 37 ° C com 5% de CO 2. Células Passage após 5 - 7 dias em cultura como listadas nas etapas abaixo. Transferência de cultura até uma 15ml cônico com uma ponta de pipeta 10 ml. </li></ol></li><li> Adicione 1 mM de EDTA em HBSS por diluição de 0,1 ml de EDTA 0,5 M pH 8,0 em 50 ml de HBSS. Pré-quente EDTA 1 mM feita em HBSS em um banho de água a 37 ° C. </li><li> Células colheita por sedimentação gravidade ou centrifugação a 200 xg durante 5 minutos. à TA. Por sedimentação por gravidade, colocar o cónico de 15 ml contendo as culturas no incubador a 37 ° C durante 5 - 10 min. Após esse tempo, observar os otospheres se acumulem na parte inferior da cónico de 15 ml. NOTA: força centrífuga excessivo pode causar danos às células. </li><li> Cuidadosamente aspirado gasto de mídia usando uma pipeta 2 ml de aspiração sem perturbar o sedimento celular. Adicionar 0,5 ml de solução de pré-aquecido a 1 mM EDTA HBSS para a célula sedimento. Com uma pipeta P1000, pipetar suavemente para cima e para baixo 2 - 3 vezes. Coloque cónica a 37 ° C e incubar durante &lt;5 minutos para facilitar a dissociação em células individuais. </li><li> Agite suavemente a solução de células para determinar se otospheres são dissociados. Se nenhum otoesferas sedimentem no fundo do cone, as células são dissociadas. O tempo de incubação pode variar. NOTA: prolongada incubação com EDTA pode resultar em morte excessiva de células. </li><li> Remover as células a partir de 37 ° C, adiciona-se 2 ml de meio para neutralizar e diluir o EDTA. Recolher as células por centrifugação a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar diluída EDTA usando uma pipeta 2 ml de aspiração e adicionar 5 ml de 1X PBS para lavar as células. </li><li> Girar para baixo as células a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente e aspirar para fora 1X PBS utilizando uma pipeta de 2 ml de aspiração. Ressuspender as células utilizando uma pipeta P1000 em 0,5 ml de meio de cultura IMOP cuidado pipetando para cima e para baixo 2 - 3 vezes. </li><li> Contagem de células utilizando um contador de partículas microfluídico com as fitas apropriadas 28. Uma placa confluente de células IMOP conterá ~ 6 X10 6 células. Dilui-se as células de 1: 100 em meio e adicionar 75 ul de uma solução de células para a cassete para contagem. Placa 1 x 10 6 células em um prato de seis centímetros no IMOP culture meios (~ 1: 10 de diluição). IMOPs passagem a cada 5 - 7 dias. NOTA: As células que formam grandes otospheres ou se ligam à parte inferior do prato de cultura de tecidos irá diferenciar. As células também vão morrer se as culturas são mais confluentes. </li></ol> 2. congelamento e descongelamento IMOP Cells <ol><li> Preparar o meio de congelamento e descongelamento sintética por equilibrar a solução a 4 ° C antes de serem células de congelação. </li><li> Recolher as células a partir de um disco de 6 cm confluente de células IMOP. Usar uma pipeta de 10 mL e de transferência de células (~ 6 - 8 x 10 6 células) num cónico de 15 ml. </li><li> Células colheita por sedimentação por gravidade ou centrifugação a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Se os otospheres são pequenas, as células não vai resolver por gravidade sedimentação. Opcional: Contagem de células usando passo 1,9 para determinar o número de células totais. </li><li> Aspirar gasto de mídia usando uma pipeta 2 ml aspiração, deixando o sedimento de células solto para trás. </li><li> Adicionar 0,25 ml de meio de congelamento sintéticos para voltar a suspender ceLLS a uma densidade de 5 x 10 ~ 5 a 3 x 10 6 células / ml. Pipeta suavemente as células com uma pipeta P1000. Transferir a suspensão de células para frascos criogénicos usando uma pipeta P1000 com 1 ml filtrados ponta. </li><li> Colocar os tubos em um recipiente de congelamento de álcool livre e colocar o recipiente de congelação a -80 ° C para reduzir a temperatura de 1 ° C por minuto até a temperatura atingir -80 ° C. </li><li> Para armazenamento a longo prazo de células, transferir os tubos de ensaio para a fase de vapor de um tanque de armazenamento de azoto líquido. Para descongelar células para a cultura, equilibrar criotubo contendo as células congelados a -80 ° C. </li><li> Pré-quente meios de cultura IMOP em um banho de água a 37 ° C. </li><li> Descongelar o frasco congelado rapidamente por agitação na parte inferior do frasco num banho de água a 37 ° C. Adicionar 1 mL de meios de cultura pré-aquecido a IMOP células descongeladas uma vez que o último cristal de gelo desaparece. Transferência de células para a 15 ml cônico e adicionar um adicional de 4 ml de meio de cultura IMOP </li><li> Gire a 15 ml conica durante 5 min. a 200 xg e aspirar o meio gasto. Ressuspender as células em 2 ml de meio de cultura de células e IMOP placa num prato de 6 cm. Incubar as culturas a 37 ° C com 5% de CO 2 para a expansão. </li></ol> 3. diferenciação de células IMOP em Sensorial Epithelia <ol><li> Prepare 50 ml de IMOP media diferenciação epitélio sensorial: DMEM / F12, suplemento 1X B27, 25 ug / ml carbenecillin. Faça 50 ml de IMOP sensorial media diferenciação do epitélio. Aquecer-se 49 ml de DMEM / F12 numa cónico de 50 ml num banho de água a 37 C °. Descongelar 50X suplemento B27 e 100 mg / ml carbenecillin alíquotas para 5 min. num banho de água a 37 ° C. Adicionar 1 ml de 50X B27 e 12,5 uL de 100 mg / ml em DMEM carbenecillin / F12. </li><li> Para a colheita, se dissociam, ressuspender e contagem de células repetir os passos 1,4-1,9 </li><li> Placa 1 X 10 6 células num prato de 6 cm no dia -3 IMOP utilizando meios de cultura. No Dia 0, as culturas de transferência utilizando uma pipeta de 10 ml para uma cónico de 15 ml. Recolher o otoesferas por gravidade sedimentação como indicado na etapa 1.6. Aspirar gasto de mídia usando uma pipeta 2 ml de aspiração e deixar as otospheres na parte inferior do cone. </li><li> Delicadamente adicionar em 2 ml de diferenciação do epitélio sensorial mídia. Transferência otospheres para um prato de 6 cm, usando um grande furo pipeta de 10 mL. NOTA: corte mecânica de pipetagem dura pode dissociar as células dos otospheres. </li><li> Adicionar 2 ml de meios sensoriais diferenciação epitelial fresco às culturas a cada dois dias. Se necessário, as células podem ser coletadas por sedimentação gravidade e mídia substituído. </li><li> Recolha otospheres no dia 10, transferindo para a 15 ml cônico e permitindo que os otospheres para sedimentar como indicado na etapa 1.6.Aspirate os meios gastos usando uma pipeta 2 ml de aspiração e deixar as otospheres imperturbável. </li><li> Fix otospheres por incubação em 4% de formaldeído em PBS 1X durante 15 min à TA. Remover solução de formaldeído, lavar otospheres com tampão de lavagem (1X PBS contendo 0,1% de Triton X-100) antes da incubação num tampão de bloqueio (1X PBS contendo 10% de soro normal de cabra e 0,1% de Triton X-100) durante 1 h. <ol><li> Substituir tampão e incubar as amostras em tampão de bloqueio com anticorpo diluído. Incubar a 4 ° C. Lavar as amostras com 1X PBS contendo 0,1% de Triton X-100 sujeita a otosphere para imunocoloração 27. Transferência otospheres em 1X PBS e colocar otospheres em meio de montagem numa lâmina de vidro usando uma pipeta P1000. Coloque uma lamela sobre a amostra e permitir a montagem de meios para secar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Adquirir imagens de epifluorescência, utilizando uma configuração de microscópio invertido equipado com uma câmera CCD de 16 bits e quer um ar 20X 0,75 ou um NA objetivo de imersão em óleo de 40X 1.3. Recolha de fluorescência de diferentes canais de cores usando a comprimentos de onda listado (excitação e emissão): azul (377 ± 25 nm / 447 ± 30 nm), verde (475 ± 25 nm / 540 ± 25 nm), vermelho (562 ± 20nm / e 625 ± 20 nm) e infravermelhos (628 ± 20nm / e 692 ± 20nm). </li></ol> 4. Assaying EdU Incorporação <ol><li> No Dia -3, placa 1 x 10 6 células IMOP em um disco de 6 cm. Três dias mais tarde, no dia 0, colheita, dissociar, ressuspender e contar as células, repetindo os passos 1,4-1,9. </li><li> Placa de 2,5 x 10 5 células em meio de cultura e IMOP 5 x10 5 células em diferenciação epitélio sensorial meios diferentes em poços de uma placa de 6 poços. </li><li> Determinar a percentagem de células em fase S por EdU incorporação no dia 3 utilizando um ensaio de incorporação de EdU <ol><li> Adicionar estoque EdU directamente às culturas IMOP para se obter uma concentração final de 1 uM EdU no meio de cultura. </li><li> Incubar EdU em culturas IMOP durante 2 horas e incubar a 37 ° C com 5% de CO 2. Colheita, dissociam e coletar células repetir os passos 1,4-1,9. Adicionar em 4% de formaldeído em PBS 1X durante 15 min. à TA para fixar as células. Células colheita por centrifugação a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Remoção da solução de formaldeído e properly dispor. </li><li> Núcleos do rótulo de células com Hoechst e incorporada EdU com verde fluorescente dye-azida de acordo com o protocolo do fabricante. NOTA: Todas as lavagens são feitas com 1X PBS, BSA a 3% e 0,1% de células Tween 20. Lavar com 1X PBS duas vezes. </li><li> Células de montagem em um slide usando antifade reagente e coloque um copo 1,5 tampa sobre a amostra. Adquirir imagens fluorescentes de células marcadas utilizando um microscópio de epifluorescência. </li></ol></li></ol> 5. Diferenciar neurônios derivados-IMOP <ol><li> Adicione 50 ml de meio de diferenciação neuronal: meios Neurobasal, 1X suplemento B27, 2 mM de L-Glutamina. Descongelar garrafa de 50X B27 e 200 mM de L-glutamina em 37 ° C num banho de água durante 5 min. Adicionar 1 ml de 50X B27 e 0,5 ml de 200 mM de L-glutamina, para 48,5 ml de meio neurobasal. </li><li> Brasão lamela, colocando 12 mm redondas 1,5 lamelas de vidro em um estéril placa de 10 cm e adicionar 70% EtOH a placa para esterilizar e limpar as lamelas. </li><li> Agite suavemente a enseadarslips para garantir que eles estão cobertos de etanol. Deixar a placa durante 10 minutos à TA. Lavar as lamelas 3 vezes com estéril 1X PBS para lavar o etanol remanescente. Lavar as lamelas uma vez com H 2 0 estéril para lavar restante 1X PBS. </li><li> Aspirar o H 2 0 usando a 2 ml de aspiração pipeta e deixar as lamelas seco. Expor as lamelas a luz UV na capa de tecido de cultura durante 15 min. Loja lamelas em um ambiente estéril se não for usado imediatamente. </li><li> Coloque uma lamela 12 milímetros rodada em cada poço de um prato de 24 poços. Agitar placa suavemente para assegurar que as lamelas ficar na posição horizontal na parte inferior do poço. </li><li> Descongelar 2 mg / ml de poli-D-lisina da solução à TA e diluir para uma concentração de 10 ug de poli-D-lisina / ml em 1X PBS. Adicionar 0,25 ml de 10 ug / ml de poli-D-lisina para os poços. Deixar a placa na incubadora a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Lavar os poços 3 vezes com PBS estéril 1X. Descongelar / solução de estoque de 10 mg mL laminina à RT e dilui-se a 10 ug / ml em PBS 1X. Adicionar 0,25 ml de 10 ug / ml de laminina solução de trabalho em um único poço de uma 24 multi-poços prato. Incubar a placa a 37 ° C incubadora. Aspirar a solução laminina utilizando uma pipeta de 2 ml de aspiração. </li><li> Lava-se a lamela 3 vezes com PBS 1X, adicionando em 1 ml de PBS 1X com uma pipeta P1000 e remover o PBS 1X por aspiração com uma pipeta de 2 ml de aspiração. Deixar 1X PBS a partir última lavagem no poço até que as células estão prontas a ser revestida. Iniciado diferenciação neuronal pela colheita, dissociando e contagem de células em passos 1.4-1.9.Plate 1 x 10 6 células em um prato de seis centímetros no Dia -3. </li><li> No Dia 0, colheita, dissociar e contar as células repetindo 1,4-1,9. Semente de 1 x 10 5 - 1,5 x 10 5 células em 0,5 ml IMOP media diferenciação neuronal pré-aquecido por cavidade em um 24 multi-poços prato. Aspirar e adicionar meios diferenciação neuronal pré-aquecido para culturas em dias alternados. </li><li> Corrigir neurônios IMOP derivados em formaldeído 4% por 15 min. umat RT no dia 7. Remover solução de formaldeído, lavar neurónios IMOP derivados com tampão de lavagem (1X PBS contendo 0,1% Triton X-100) antes da incubação num tampão de bloqueio (1X PBS contendo 10% de soro normal de cabra e 0,1% de Triton X-100) durante 1 h. <ol><li> Substituir tampão e incubar as amostras em tampão de bloqueio com anticorpo diluído. Incubar a 4 ° C. Lavar as amostras com PBS 1X contendo 0,1% de Triton X-100 As células sujeitas a imunocoloração 27. Lavar a lamela com 1X PBS, antes de colocar em suportes de montagem. Permitir que os meios de montagem para secar a 4 ° C antes de adquirir imagens de epifluorescência como listado no passo 3.8. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Monitoramento culturas IMOP Um protocolo para a manutenção de auto-renovação e promover a diferenciação de uma linhagem celular IMOP romance é descrito e formatos chapeamento adicionais são incluídos (Tabela 1). Vários passos críticos que ajudam com a expansão e diferenciação de células IMOP rotina são anotados. Semelhante a culturas de células estaminais pluripotentes, células IMOP tem, teoricamente, um tempo de vida indeterminado. Para garantir que as linh...

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One of the authors' names was corrected from:
Jadali Azadeh
to:
Azadeh Jadali

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Erratum: Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Os órgãos do ouvido interno, cóclea, utrículo, sáculo e três canais semicirculares, medeiam a capacidade de ouvir e equilibrar. Dentro da cóclea, as células ciliadas convertem sons em sinais elétricos que são retransmitidos para os neurônios do gânglio espiral (SGN). Os SGNs disparam potenciais de ação para propagar sinais neurais através do circuito auditivo. Mutações genéticas, drogas ototóxicas e exposição a sons altos contribuem para a morte das células ciliadas e do NSG que resultam em perda auditiva1-4. Uma vez perdidas, essas células não são substituídas. O uso de iPSC e ESC para gerar células ciliadas nascentes ou SGNs é uma grande promessa para terapias de reposição de células da orelha interna5-8. Uma enxurrada de progresso mostrou que células-tronco pluripotentes e progenitores derivados do ouvido interno podem se diferenciar em células ciliadas e SGNs em vários estágios de maturidade. Células-tronco embrionárias de mamíferos (ESC) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) podem ser usadas para gerar células ciliadas funcionais e SGNs9-11. Células-tronco e células progenitoras derivadas do ouvido interno de mamíferos também demonstraram formar células ciliadas e neurônios com propriedades de suas contrapartes celulares in vivo 12-16. 
O uso de progenitores óticos derivados de iPSC ou ESC para substituir células ciliadas perdidas e SGNs requer diferenciação eficiente. A diferenciação inadequada ou a proliferação contínua de progenitores derivados do caule enxertados na orelha interna podem exacerbar a função da orelha interna e representar um risco tumorigênico, como a formação de teratomas na orelha interna17. Há uma clara necessidade de desenvolver condições de cultura e entender a diferenciação de progenitores óticos. Uma estratégia no desenvolvimento desses métodos é recapitular as decisões de destino celular tomadas por progenitores neurossensoriais durante o desenvolvimento do ouvido interno. Protocolos que previnem a proliferação e direcionam progenitores óticos para as células ciliadas ou SGNs ajudarão a melhorar a segurança e a eficácia das terapias de reposição. 
Durante o desenvolvimento, o ouvido interno começa com o espessamento do ectoderma superficial em uma região restrita entre os rombomeros 5 e 6 para se tornar o placódio ótico. À medida que o placódio ótico invagina para formar uma taça ótica, uma coleção de células na região anterior da taça ótica dá origem ao domínio neural-sensorial-competente (NSD), que contém precursores de células ciliadas e neurônios da orelha interna18. Estudos de mapeamento de destino de camundongos, galinhas e peixes-zebra desenvolvendo o ouvido interno sugerem múltiplas populações de progenitores neurossensoriais que dão origem às células ciliadas sensoriais, ao redor das células de suporte e neurônios óticos19-22. O fator de transcrição do grupo de alta mobilidade, Sox2, tem sido implicado na especificação de células sensoriais e usado como marcador para progenitores da orelha interna23,24. Mutações hipomórficas que diminuem os níveis de expressão de Sox2 na orelha interna resultam na perda das células ciliadas, células de sustentação e SGNs na cóclea25,26. 
Para estudar células progenitoras óticas submetidas a decisões de destino celular, uma linhagem celular de progenitor ótico multipotente imortalizado restrito ao destino (iMOP) de progenitores cocleares que expressam Sox2 foi previamente estabelecida. As células iMOP foram originalmente derivadas da cóclea embrionária E12.5-13.5 e infectadas com um retrovírus c-Myc27. As células iMOP podem proliferar continuamente como células formadoras de colônias conhecidas como otosferas e têm a capacidade de se diferenciar em células ciliadas, células de suporte e SGNs27. Compreender a capacidade das células iMOP de se diferenciar em linhagens óticas distintas permite a aplicação desses achados para gerar eficientemente células ciliadas derivadas de iPSC ou ESC e SGNs. Protocolos de diferenciação eficientes abrirão novos caminhos para terapias de substituição celular de doenças do ouvido interno que são recalcitrantes aos tratamentos convencionais. Uma questão crucial na geração de células óticas por cultura de células in vitro é ter marcadores de diferenciação que ajudem a determinar se as células estão passando por diferenciação. Cdkn1b (p27KIP) tem sido amplamente utilizado como um marcador precoce para diferenciação no desenvolvimento da orelha interna, no entanto, a expressão de Cdkn1b em células iMOP e como ela se correlaciona com a diferenciação não foi abordada. Neste estudo, são descritas as condições atuais da cultura e como a expressão de Cdkn1b se correlaciona com outros marcadores de diferenciação de iMOP.

<table><tbody><tr><td>CoolCell LX Recipientes de Congelamento de Células Sem Álcool</td><td>Frascos Criogênicos BioCision</td><td>BCS-405</td><td></td></tr><tr><td>(2 ml)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430654</td><td></td></tr><tr><td>1.5 Espessura de lamínula de vidro (Redondo 12 mm)</td> <td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>72230-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-082</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Solução Salina Balanceada (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B27 (50X) Serum Free</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>Armazenado como alíquotas de 1 ml</td></tr><tr><td>L-Glutamina(200 mM)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Armazenado como alíquotas de 5 ml</td></tr><tr><td>Laminina de Rato Natural</td><td>Life Technologies</td><td>23017-015</td><td>Armazenado como alíquotas de 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>C10337</td><td></td></tr><tr><td>Synth-A-Freeze Mídia de Criopreservação</td><td>Life Technologies</td><td>A12542-01</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>47743-736</td><td>Armazenado como 10 mg/ml 100 &micro; l alíquotas</td></tr><tr><td>Moxi Z Mini Contador de Células Automatizado</td><td>Orflo&nbsp;</td><td>MXZ001</td><td></td></tr><tr><td>Moxi Z Tipo S</td><td>Orflo&nbsp;</td><td>MXC002</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento de fibroblastos murinos recombinantes, básico (bFGF)</td> <td>Peprotech</td><td>450-33</td><td>ressuspenso em 0,1% BSA em H20 e armazenado como alíquotas de 20 mg / ml</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P7886</td><td>ressuspenso em 1X PBS e armazenado como 10 mg / ml 100 &micro; l alíquotas</td></tr><tr><td>Carbenicilina, Sal Dissódico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2648-1</td><td>Ressuspensa em Hepes de 10 mM pH 7.4 e armazenada como alíquotas de 100 mg/ml</td></tr><tr><td>Pipeta de 5 ml embalada individualmente em brochura (200/caixa)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipeta embalada individualmente brochura (200/caixa)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367811E</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 Poços Biolite Tratada para Cultura de Tecidos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 Poços Biolite Tratada com Cultura de Tecidos</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 130184&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Prato de 6 cm para Cultura de Tecidos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130181&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Filtro estéril da seringa PVDF de EMD Millipore Millex Tamanho do poro: 0,22 &mu; m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>TipOne pontas de pipeta de filtro 0.1 - 10 &mu; l ponta de filtro alongada</td><td>USA Scientific</td><td>1120-3810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne pontas de pipeta de filtro 1 - 20 &mu; l ponta de filtro</td><td>USA Scientific</td><td>1120-1810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne pontas de pipeta de filtro 1 - 200 &mu; l&nbsp; ponta de filtro</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta de filtro TipOne 101 - 1000 &mu; l ponta de filtro</td><td>USA Scientific</td><td>1126-7810</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de 15 ml estéreis 20 sacos de 25 tubos (500 tubos)</td> <td>USA Scientific</td><td>1475-0511</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de 50 ml estéreis 20 sacos de 25 tubos (500 tubos)</td> <td>USA Scientific</td><td>1500-1211</td><td></td></tr></tbody></table>

iniciando a diferenciação em células multipotentes imortalizadas otic progenitoras

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

O uso de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC) ou células-tronco embrionárias (ESC) para terapias de reposição celular é uma grande promessa. Várias limitações, incluindo baixos rendimentos e populações heterogêneas de células diferenciadas, dificultam o progresso das terapias com células-tronco. Uma linhagem celular de progenitor ótico multipotente imortalizado restrito ao destino (iMOP) foi gerada para facilitar a diferenciação eficiente de um grande número de células ciliadas funcionais e neurônios do gânglio espiral (SGN) para terapias de substituição de células do ouvido interno. A partir de culturas dissociadas de células iMOP únicas, foram descritos protocolos que promovem a saída e diferenciação do ciclo celular pela retirada do fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF). Uma diminuição significativa nas células em proliferação após a retirada do bFGF foi confirmada usando um ensaio de proliferação de células EdU. Concomitante com uma diminuição na proliferação, a diferenciação bem-sucedida resultou na expressão de marcadores moleculares e alterações morfológicas. A imunomarcação de Cdkn1b (p27KIP) e Cdh1 (E-caderina) em otosferas derivadas de iMOP foi usada como um indicador de diferenciação em epitélio sensorial da orelha interna, enquanto a imunomarcação de Cdkn1b e Tubb3 (β-tubulina neuronal) foi usada para identificar neurônios derivados de iMOP. O uso de células iMOP fornece uma ferramenta importante para entender as decisões de destino celular tomadas por progenitores neurossensoriais do ouvido interno e ajudará a desenvolver protocolos para gerar um grande número de células ciliadas derivadas de iPSC ou ESC e SGNs. Esses métodos acelerarão os esforços para gerar células óticas para terapias de reposição.

bFGF retirada diminui a proliferação em células IMOP Para diminuir a capacidade proliferativa de células IMOP e iniciar a diferenciação de células IMOP, bFGF foi retirado das culturas. Para confirmar que o fator de crescimento retirada diminui a proliferação, EdU incorporação foi empregado como um ensaio de proliferação. Foi comparada com a percentagem de células que incorporaram EdU de otospheres cultivadas c...

Os protocolos atuais para manter células progenitoras óticas multipotentes imortalizadas (iMOP) e diferenciação ótica são descritos. As condições de cultura e os marcadores moleculares que indicam diferenciação em epitélio sensorial e neurônios ganglionares espirais (SGN) são destacados.

Iniciando A diferenciação em células multipotentes imortalizadas Otic progenitoras

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

O objetivo geral deste procedimento é diferenciar células progenitoras óticas multipotentes imortalizadas em tipos de células do ouvido interno. Portanto, esse método pode nos ajudar a abordar questões-chave na regeneração auditiva, como como os progenitores óticos podem se tornar células ciliadas da cóclea ou neurônios auditivos. É importante ressaltar que esta técnica fornece um sistema celular in vitro que pode ser usado em paralelo com sistemas de modelos animais mamíferos in vivo.Demonstrando o procedimento hoje estarão Azadeh Jadali, uma pós-doutoranda em meu laboratório, bem como Zhichao Song e Alejandra Laureano, duas estudantes de pós-graduação no laboratório. Depois de preparar o meio de cultura conforme descrito no protocolo de texto, use três mililitros desse líquido para colocar um vezes dez elevado ao sexto progenitor multipotente imortalizado, ou células IMOP, em uma placa de cultura de tecidos de 60 milímetros. Incube as células por cinco a sete dias a 37 graus Celsius com cinco por cento de dióxido de carbono.A cada dois dias, dobre o volume de líquido na cultura adicionando meio fresco. Para passar as células, primeiro transfira-as da placa de cultura para um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, coloque o tubo, a 37 graus Celsius, por cinco a dez minutos.Durante esse período, espere que as otosferas formadoras de colônias se acumulem no fundo da por meio da sedimentação por gravidade. Em seguida, aspire o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar a paleta. Ressuspenda as otosferas adicionando 0,5 mililitros de solução salina balanceada aprimorada com EDTA milimolar ou HBSS pré-aquecida previamente preparada e, em seguida, pipetando para cima e para baixo duas a três vezes.Para facilitar a dissociação das otosferas em células únicas, coloque o cônico em uma incubadora a 37 graus Celsius. Agite periodicamente a solução e quando nenhuma otosfera for observada como sedimento no fundo do tubo, mova-a para a temperatura ambiente. Prossiga para adicionar dois mililitros de meio de cultura às células para neutralizar o EDTA.E centrifugue-os em temperatura ambiente por cinco minutos a 200 gs. Em seguida, aspire a solução diluída de EDTA e lave as células em cinco mililitros de 1x PBS. Depois de girar as células usando as mesmas configurações, aspire o PBS 1x.Em seguida, adicione 0,5 mililitros de meio de cultura ao cônico. E ressuspenda a paleta de células. Para contagem, diluir as células IMOP de uma a cem em meio de cultura.Em seguida, adicione 75 microlitros desta solução em um posicionado em um contador de partículas microfluídicas e determine o número de células. Em seguida, coloque um em placas dez elevado à sexta célula IMOP em uma placa de cultura de tecidos de 60 milímetros, conforme descrito anteriormente, e repita esse procedimento de passagem a cada cinco a sete dias. Três dias após o reforço, use a sedimentação por gravidade para coletar as otosferas, conforme mostrado anteriormente.Prossiga para aspirar o sobrenadante. E ressuspenda suavemente as células em dois mililitros de meio de diferenciação epitelial sensorial. Em seguida, use uma pipeta de poros grandes de dez mililitros para transferir as otosferas para um novo prato de 60 milímetros.Diferencie as otosferas por dez dias. Adicionar dois mililitros de meio de diferenciação fresco à cultura a cada dois dias. Em seguida, colha novamente as otosferas por sedimentação por gravidade.E aspirar o meio gasto. Em seguida, fixe as otosferas em quatro por cento de paraformaldeído em 1x PBS por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, remova a solução de formaldeído e lave as células em 1x PBS contendo 0,1% de Triton x100.Prossiga bloqueando as otosferas em 1x PBS suplementado com dez por cento de soro de cabra e 0,1 por cento de Triton x100. Após uma hora, substitua o tampão de bloqueio por um contendo a diluição apropriada do anticorpo Cdkn1b ou CDH1. Em seguida, incube as células no anticorpo primário durante a noite a quatro graus Celsius.E no dia seguinte continue a imunocoloração usando anticorpos secundários marcados com fluorescência, Faloidina e Hoechst, conforme descrito em outro lugar. Para se preparar para a imagem, coloque o meio de montagem em uma lâmina de vidro. E então introduza as otosferas coradas no meio.Em seguida, coloque uma lamínula em cima da amostra. Depois de deixar o meio de montagem secar durante a noite a quatro graus Celsius, coloque a lâmina no palco de um microscópio invertido equipado com uma câmera CCD de 16 bits. Usando a objetiva de ar 20x 0,75, adquira imagens de epifluorescência coletando dados dos canais azul, verde, vermelho e infravermelho.Primeiro, limpe as lamínulas de vidro redondas, colocando-as em uma placa estéril de 100 milímetros e submergindo-as em etanol a 70%. Agite suavemente as lamínulas para garantir que estejam cobertas e deixe o prato em temperatura ambiente por dez minutos. Em seguida, enxágue as lamínulas três vezes em 1x PBS estéril e depois uma vez com água estéril.Em seguida, deixe as lamelas secarem, expondo-as à luz ultravioleta em uma capa de cultura de tecidos por 15 minutos. Para uso imediato, coloque uma lamínula estéril em cada poço de uma placa de 24 poços. E agite suavemente a placa para garantir que todas as lamínulas fiquem planas.Em seguida, cubra as lamínulas adicionando 0,25 mililitros de 1x PBS contendo 10 micrógamos por mililitro de poli D lisina a cada poço. Após a placa ter incubado por uma hora a 37 graus Celsius, remova a solução de poli D lisina e lave os poços três vezes com 1x PBS estéril. Uma vez aspirado o líquido da última lavagem, introduza 0,25 mililitros de 1x PBS contendo 10 microgramas por mililitro de Laminina, em cada um dos 24 poços.Depois de incubar a placa durante a noite a 37 graus Celsius, aspire a solução de laminina e, em seguida, lave cada poço com um mililitro de 1x PBS três vezes, mas deixe o PBS da última lavagem nos poços até que as células estejam prontas para serem plaqueadas. Para iniciar a diferenciação neuronal, conte as células das otosferas dissociadas conforme descrito anteriormente. E então ressuspendê-los em meio de diferenciação neuronal pré-aquecido.Proceder semeando entre uma e uma vírgula cinco vezes dez elevado à quinta célula IMOP em cada alvéolo da placa que contém as lamínulas revestidas. Incube a placa a 37 graus Celsius, com cinco por cento de dióxido de carbono. Substituindo o meio de diferenciação neuronal a cada dois dias.Após sete dias, aspire o meio e fixe as células, que devem ser presas às lamínulas, adicionando quatro por cento de formaldeído em cada poço. E deixando-os por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, remova o formaldeído e lave as células uma vez em 1x PBS contendo 0,1 por cento de Triton x100.Em seguida, remova o tampão de lavagem. E adicione tampão de bloqueio consistindo em 1x PBS contendo dez por cento de soro de cabra normal e 0,1 por cento de Triton x100 para cada poço. Deixe as células por uma hora em temperatura ambiente.Em seguida, remova o líquido e substitua-o por um tampão de bloqueio contendo a diluição apropriada do anticorpo Cdkn1b ou Tubb3. Após uma incubação noturna a quatro graus Celsius, lave as células uma vez com 1x PBS contendo um por cento de Triton x100. E então prossiga com a imunocoloração conforme descrito anteriormente.Após a conclusão da coloração, faça uma lavagem final adicionando 1x PBS aos poços. Para prepará-los para análise, remova as lamínulas às quais as células coradas estão presas da placa de 24 poços. E coloque-os no meio de montagem em uma lâmina de vidro.Depois de deixar o meio de montagem secar durante a noite a quatro graus Celsius, adquira imagens de epifluorescência conforme descrito anteriormente. Otosferas cultivadas por dez dias em meio de diferenciação epitelial demonstram aumento da expressão de Cdkn1b, um inibidor de quinase dependente de ciclagem e marcador para diferenciação da orelha interna, em comparação com células indiferenciadas. Aqui, a coloração de Hoechst observou os núcleos das células.Essas células também exibem alterações morfológicas nos filamentos de actina e regiões de adesão célula-célula características do epitélio. Indicado pelo aparecimento de faloidina e marcação de Cdh1 nas periferias celulares. As otosferas também podem ser direcionadas para formar neurônios.Esta imagem de campo brilhante mostra que, após sete dias em meio de diferenciação neuronal, as células IMOP exibem neurites. A imunomarcação dessas células com um marcador neuronal Tubb3 confirma sua diferenciação. E eles também expressam Cdkn1b de forma robusta.Isso sugere que o sinal duplo Tubb3, Cdkn1b pode ser usado como um indicador de diferenciação neuronal em células IMOP. As células diferenciadas e indiferenciadas de fluorescência Cdkn1b também foram normalizadas pela determinação de sua razão para o sinal de Hoechst, fornecendo resultados quantitativos. Histogramas desses dados são mostrados aqui.As porcentagens de células IMOP indiferenciadas e diferenciadas acima de um limite predeterminado de Cdkn1b normalizado são apresentadas nesses gráficos. Ambas as populações diferenciadas demonstram um aumento significativo na porcentagem de células que expressam Cdkn1b em comparação com controles indiferenciados, confirmando a diferenciação sugerida pela imunofluorescência. Uma vez dominado, a cultura de rotina e a diferenciação de células IMOP podem ser feitas em 30 minutos, se forem realizadas corretamente.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como iniciar a diferenciação das células IMOP. Obrigado por assistir a este vídeo. E boa sorte com seus experimentos.

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Research

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