Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren ist es, hochgereinigte Neutrophile aus menschlichen Blutproben durch Dichtegradientenzentrifugation schnell zu isolieren, um ihre Rolle bei der Empfindlichkeit von Lymphomzellen gegenüber der Krebstherapie unter Verwendung von Zwei-D- und Drei-D-Zellkulturmodellen zu untersuchen. Diese Methoden können helfen, wichtige Fragen zu den Wechselwirkungen zwischen dem angeborenen Immunsystem und Krebs zu beantworten, z. B. welche Rolle eine durch Neutrophile vermittelte Tumorzellantwort in der Krebstherapie spielt. Der Hauptvorteil der Dichtegradiententrennung besteht darin, dass reine Immunzellpopulationen in kurzer Zeit isoliert werden können, ohne die Zellen funktionsverändernden Reizen auszusetzen.

Um die primären leukämischen Zellen und Neutrophilen zu isolieren, beginnen Sie mit der Zugabe von 15 Millilitern EDTA-behandeltem Blut aus Patientenproben mit chronischer lymphatischer Leukämie in einzelne, sterile 50-Milliliter-Röhrchen. Verdünnen Sie das Blut mit 15 Millilitern RPMI. Geben Sie dann vorsichtig und langsam 15 Milliliter Dichtegradientenlösung bei Raumtemperatur unter das Blut und achten Sie darauf, die Schichten nicht zu vermischen.

Nach der Trennung der Zellen durch Zentrifugation sind vier verschiedene Phasen sichtbar. Oben die Blutplättchen und das Plasma, unten ein weißer Ring aus mononukleären Zellen, die Dichtegradientenlösung und die Granulozyten und Erythrozyten. Mit einer Weidepipette aus Kunststoff wird zunächst der weiße Ring der primären Leukämiezellen in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen übertragen.

Waschen Sie die Zellen mit bis zu 50 Millilitern PBS mit Calcium und Magnesium. Und lassen Sie den Gaumen in fünf Millilitern frischem PBS wieder suspendieren. Geben Sie dann weitere 45 Milliliter PBS in die Zellen und schleudern Sie die Zellen wieder herunter.

Nach dem zweiten Waschen den Gaumen wieder in vollständigem RPMI-Medium suspendieren. Und zählen Sie die Anzahl lebensfähiger primärer leukämischer Zellen. Entfernen Sie anschließend die Thrombozytenplasma- und Dichtegradientenschichten und fügen Sie 25 Milliliter PBS und 25 Milliliter Dextrin in Natriumchlorid zur Granulozyten-Erythrozytenphase hinzu.

Mischen Sie die Röhrchen zehnmal durch Inversion. Lassen Sie die Zellen dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur ruhen. Am Ende des Gleichgewichts übertragen Sie die obere Schicht der armen Neutrophilen Blutkörperchen in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen und schleudern die Zellen nach unten.

Resuspendieren Sie den Gaumen in fünf Millilitern PBS und lysieren Sie die roten Blutkörperchen mit 45 Millilitern Erythrozyten-Lysepuffer. Nach 15 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur schleudern Sie die Zellen wieder herunter und waschen den Gaumen in 50 Millilitern PBS. Am Ende des Waschvorgangs suspendieren Sie die Zellen wieder im vollständigen RPMI-Medium und zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Neutrophilen.

Verdünnen Sie beide Zellgruppen auf 300.000 Zellen pro 50 Mikroliter RPMI-Konzentration und verteilen Sie die Proben auf die entsprechende Anzahl von fünf Millilitern Faxschläuchen. Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie die Pellets in 50 Mikrolitern PBS, die mit FBS ergänzt sind. Um die Reinheit der isolierten Zelluntergruppen zu bestimmen, wird das Aliquant von primären leukämischen Zellen mit anti-humanCD19-Antikörpern, die an APC konjugiert sind, und das Aliquant der gereinigten Neutrophilen mit einer Mischung aus anti-humanen Antikörpern, wie in der Tabelle aufgeführt, für 30 Minuten im Dunkeln bei vier Grad Celsius markiert.

Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen in 500 Mikrolitern FBS, ergänzt PBS, und resuspendieren Sie die Gaumen in 200 Mikrolitern frischem FBS PBS. Analysieren Sie dann die Reinheit der Zellpopulationen durch Durchflusszytometrie und achten Sie darauf, die Proben farblich zu kompensieren. Um die primären leukämischen Zellen mit den autologischen Neutrophilen zu co-kultivieren, sehen Sie 200.000 Zellen pro Milliliter leukämischer Zellen allein oder mit autologischen Neutrophilen in einer 24-Well-Platte in vollständigem RPMI-Medium.

Mischen Sie die Zellen vorsichtig. Behandeln Sie die Zellen dann 24 Stunden lang mit dem Tyrosinkinase-Hemmer von Brutton bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2. Am nächsten Tag sammeln Sie ein Aliquant der Zellen in einem fünf Milliliter großen Faxschlauch aus Kunststoff.

Schleudern Sie dann die Zellen herunter und waschen Sie die Pellets in einem Milliliter FBS PBS. Nach der zweiten Zentrifugation die Zellen Aninexin fünf und Propidiumiodid gemäß den Herstellerangaben zehn Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln markieren. Analysieren Sie dann die Neutrophilen und primären leukämischen Zellen durch Durchflusszytometrie unter Verwendung der dargestellten Gating-Strategie.

Um eine Drei-D-Co-Kultur einzurichten, fügen Sie 50.000 RL-Lymphom-B-Zellen allein hinzu oder mischen Sie sie mit HL60-differenzierten Zellen in sterilen 15-Milliliter-Röhrchen. Schleudern Sie die Proben herunter und resuspendieren Sie die Pellets in 300 Mikrolitern Basalmembranmatrix, wobei Sie eine ein Millimeter lange Pipettenspitze verwenden, deren Öffnung auf zwei bis drei Millimeter geschnitten ist. Als nächstes inkubieren Sie 300 Mikroliter der Zellen in jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2.

Am Ende der Inkubation geben Sie einen Milliliter vollständiges RPMI-Medium in jede Vertiefung und geben Sie die dreiD-Kulturen für weitere sieben Tage in den Inkubator zurück, wobei das Medium alle zwei Tage gewechselt wird. Am fünften Tag fügen Sie den Kulturen zehn Nanomolare Incristin hinzu. Nach einer Woche Kultur aspirieren Sie das Medium und waschen Sie jede Füllung zweimal mit einem Milliliter eiskaltem PBS.

Geben Sie dann drei Milliliter eiskaltes PBS mit EDTA in jede Vertiefung und kratzen Sie den Boden der Vertiefungen mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze ab, um die Gele zu lösen. Schütteln Sie den Teller 30 Minuten lang vorsichtig auf Eis. Übertragen Sie dann die Zellsuspensionen in einzelne sterile 15-Milliliter-Röhrchen, um sie weitere 30 Minuten lang sanft auf Eis zu schütteln.

Bestätigen Sie das Erscheinungsbild einer homogenen Zellsuspension. Schleudern Sie dann die Zellen herunter, gefolgt von einer PBS-Wäsche und resuspendieren Sie die Pellets in frischem PBS mit FBS. Markieren Sie abschließend die Zellen mit den entsprechenden Antikörpern und Viabilitätsfarbstoffen, wie gerade gezeigt, und analysieren Sie die RL- und HL60-differenzierten Zellen mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung der dargestellten Gating-Strategie.

Die Analyse aller Ereignisse der isolierten Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie zeigt, dass diese Trennmethode zu einer hochreinen CD19-exprimierenden primären leukämischen Zellpopulation mit einem Peak führt. Und eine zu mehr als 90 Prozent reine Neutrophilenpopulation, die positiv für die Leukozyten-Antigene CD45 und die CD15- und CD16-Antigene ist, die von reifen Neutrophilen exprimiert werden. Die Gangbestimmung an den primären leukämischen Zellen aus neutrophilen Co-Kulturen zeigt, dass die Neutrophilen eine schützende Wirkung auf das Zellüberleben gegen den Tyrosininhibitor Ibrutinib ausüben, mit einer signifikant höheren Anzahl lebensfähiger primärer leukämischer Zellen im Vergleich zur alleinigen Kultur primärer leukämischer Zellen.

Differenzierte HL60-Zellen sind in drei D-Kulturen stabiler als Neutrophile. Nach Induktion ihrer granulozytären Entwicklung sind diese Zellen kleiner als undifferenzierte HL60-Zellen und exprimieren höhere Spiegel von CD11B und CD38. Differenzierte HL60-Zellen weisen auch mehrlappige Zellkerne auf.

Diese Zellen zeigen eine protektive Wirkung auf die RL-Zellen mit einer signifikant höheren Anzahl lebensfähiger RL-Zellen in drei D-Co-Kulturen nach der Vincrostin-Behandlung im Vergleich zu Vincrostin-behandelten Lymphomzellen, die allein kultiviert wurden. Einmal gemeistert, kann die Dichtegradientenzentrifugationsmethode in 90 Minuten abgeschlossen werden. Nach ihrer Entwicklung ebneten diese Techniken den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Krebsbiologie, um den Einfluss verschiedener weißer Blutkörperchen auf die Tumorbösartigkeit in präklinischen Modellen und Patientenproben zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mononukleäre Zellen und Neutrophile schnell und zuverlässig isolieren, die Wirkung von Neutrophilen auf die Vermittlung von Tumorzellreaktionen auf Krebsmittel analysieren und eine Drei-D-Co-Kultur einrichten können.