יישומים של-הבדיקה הבודדה: הדמיה ספקטרומטריית מסה וניתוח תא יחיד בתנאי הסביבה

המטרה הכוללת של שיטה זו היא ליצור התקן דגימה בקנה מיקרו, ה-Single-probe, לצורך ניתוח תאים בודדים חיים באמצעות ספקטרומטריית מסות בתנאים סביבתיים, ולביצוע דימות בספקטרומטריית מסות סביבתית של רקמות ביולוגיות ברזולוציה מרחבית גבוהה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח במחקרים ביולוגיים ופרמצבטיים.

כגון אילו מולקולות נוכחות בתאים בודדים חיים, וכיצד הן מפוזרות ברקמות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהגשש הבודד הוא התקן רב-תכליתי שניתן להשתמש בו הן לניתוח תאים בודדים חיים והן לניסויי דימיג מספקטרומטריית מסות סביבתית ברזולוציה גבוהה. למרות שניתן להשתמש בשיטה זו לניתוח תאים בודדים ורקמות, ניתן להחילה גם על מערכות אחרות שבהן דגימה בקנה מידה מיקרוסקופי היא רצויה, כגון ניתוח מרחבי של כימיקלים, מיקרו-מושבות וביופילמים חיים.

את הפרוצדורה ידגים יחד איתי Wei Rao, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. הניחו איבר שלם של עכבר, המעניין אתכם, למרכזו של באר פלסטיק קטנה. טבלו את האיבר בתרכובת להטמעת רקמות עד לגובה של כ-10mm.

העבירו מיד את הרקמות לחנקן נוזלי להקפאה מהירה (flash freezing). להכנת חיתוך של רקמת עכבר, קחו את איבר העכבר הקפוא והמיסו אותו עד לטמפרטורה של 15 degrees Celsius במיקרוטום קריוגני (cryo-microtome) בעל בקרת טמפרטורה. קבעו את הרקמה לבסיס פלדה באמצעות כ-500 microliters של תרכובת לקיבוע רקמות (tissue embedding compound), והניחו אותה על מתקן החיתוך של המיקרוטום הקריוגני כך שהכיוון הרצוי לחיתוך יהיה מופנה אל הלהב.

בצעו חיתוך של הרקמה לעובי של 12 מיקרון. לאחר מכן, הניחו את פרוסות הרקמה החתוכות על שקופיות מיקרוסקופ מפוליקרבונט והשאירו אותן להתייבש למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. השיגו דגימת תאים, כגון 1 מיליליטר של HeLa Cell Suspension, והוסיפו אותה ל-9mL של מצע תרבית תאים מלא בצלחת תרבית תאים סטנדרטית של 10 ס"מ.

שמרו את התאים בתרבית בטמפרטורה של 37 °C, עם 5% CO2 למשך יומיים עד שלושה ימים, עד ששטח הצמיחה בצלחת תרבית התאים יהיה מכוסה ב-70-80%. בצעו מעבר תאים (passaging) בצלחת תרבית התאים. לשם כך, שאבו את מצע הצמיחה ושטפו את התאים עם 5 mL של 1x phosphate buffered saline.

הסיר את ה-PBS באמצעות טיפ שאיבה סטרילי והדגר את התאים עם 2.5mL של trypsin למשך כ-5 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius כדי לנתק את התאים מלוח התרבית. עצור את פעילות ה-trypsin על ידי הוספת 7.5mL של מצע גידול תאים מלא, ולאחר מכן, השהה את התאים באופן אחיד. כדי להכין את דגימות התאים לניסוי ספקטרומטריית מסות של תא בודד (single-cell mass spectrometry), או SCMS, הנח תחילה כיסויות מיקרוסקופיות בודדות לתוך בארות של לוח בעל 12 בארות.

לאחר מכן, הוסף לבאר 1.8mL של מצע גידול לתאים ו-0.2mL של תרחיף תאים. ערבב בעדינות את התאים על ידי ניעור קל של הפלטה לפני הדגרה בסביבה של 5%CO2 בטמפרטורה של 37 degrees Celsius, למשך כ-24 שעות. כדי לבצע טיפול תרופתי בתאים המגודלים, הוסף תמיסת תרכובת תרופתית לפלטת גידול התאים בעלת 12 הבארים.

הניחו את צינור הקוורץ בעל הלומן הכפול במכשיר למשיכת מיקרו-פיפטות לייזר, ומשכו מחט קוורץ בעלת לומן כפול. כנקודות התחלה, הגדירו את החום ל-400, את הפילמנט ל-3, את המהירות ל-80, את ההשהיה ל-150, ואת המשיכה ל-250. חתכו את קצה המשיכה כך שיישאר כ-5mm של קפילרית קוורץ בעלת לומן כפול שלא נמשכה בקצה השני.

חתוך מקטע של 80mm של קפילרית סיליקה מותכת (fused silica) שתשמש כקפילרית לספק הממס. לאחר מכן, הכנס את הקפילרית לאחד החורים בקצה השטוח של מחט הקוורץ בעלת שני החורים. השתמש בלהבה כדי למתוח קפילרית סיליקה מותכת כפולט nanoESI, חתוך אותה לאורך של 7-10mm והכנס אותה לחור השני בקצה השטוח של מחט הקוורץ בעלת שני החורים.

מרחו כמות מינימלית של שרף הקשחה ב-UV על הקצה השטוח של מחט הקוורץ בעלת שני החורים. הקשיחו את השרף באמצעות מנורת LED UV למשך כ-20 שניות, כדי לקבע את הנימי המספק את הממס ואת פולט ה-nanoESI. לאחר מכן, חיתכו למחצית לאורכו שקופית זכוכית סטנדרטית למיקרוסקופ.

לאחר מכן, הניחו את ה-single-probe על קצה אחד של השקף, כך שהפולט של ה-nanoESI פונה החוצה. מרחו אפוקסי רגיל על גוף ה-single-probe כדי להצמידו לשקף, והשאירו למשך לילה להקשחה. מערכת זו כוללת אঢাকার ממשק מותאמים אישית של מקור יונים בספקטרומטר המסה, ולוח אופטי מאלומיניום המחובר למיקרוסקופ דיגיטלי USB, במה של תרגום XYZ ידני מיניאטורי ובמערכת תרגום XYZ ממונעת.

שנו את אבחורי הממשק של מקור היונים בספקטרומטר המסה והכינו את המעמד של הסטריאומיקרוסקופ הדיגיטלי כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. חברו ללוח האופטי מאלומיניום את הסטריאומיקרוסקופ הדיגיטלי המשונה, מיקרוסקופ דיגיטלי USB, במה XYZ ידנית מיניאטורית עם מחזיק סריג גמיש, ואת מערכת במי XYZ הממונעת. השתמשו במחזיק הסריג הגמיש כדי לקבע את זכוכית המיקרוסקופ שעליה מחובר Probe בודד.

לאחר מכן, חברו את מערך הפרובה הבודדת לספקטרומטר המסה. כוונו את מחזיק התפס הגמיש ואת במת ה-XYZ המיניאטורית כדי למקם את הפולט של הפרובה הבודדת מול פתח הכניסה של ספקטרומטר המסה. הפשיתו את נתח הדגימה בטמפרטורה של החדר, והניחו אותו על מערכת במת ההזזה הממוטרת XYZ שמתחת לפרובה הבודדת.

כוון את מיקום הדגימה על ידי שינוי הקואורדינטות בתוכנת הבקרה. השתמש במזרק כדי להזרים את ממס הדגימה בקצב המתאים. לאחר מכן, גרם למתח היינוז.

כווננו את גובה הגשש הבודד כך שיישען מעט מעל פני הדגימה, באופן שיאפשר ביצוע חילוץ שCח של מטבוליטים. הרימו בזהירות את במת ה-Z, ולאחר מכן השתמשו במיקרוסקופ הדיגיטלי המחובר ב-USB כדי לנטר את שינוי המרחק בין קצה הגשש הבודד לפני השטח של הרקמה. הגדירו את הפרמטרים לסריקה רסטריית (rastering) על פני החלק הרלוונטי בדגימה.

עבור חתיכות הכליות של העכבר המוצגות כאן, השתמשו במהירות סריקה של 10 micrometer per second ובמרחק של 20 micrometer בין הקווים. הגדירו את פרמטרי הסריקה על פני החלק הרלוונטי בדגימה. עבור חתיכות הכליות של העכבר המוצגות כאן, השתמשו במהירות סריקה של 10.0 micrometer per second ובמרחק של 20 micrometer בין הקווים.

הגדירו שיטה לרכישה אוטומטית של ספקטראלים של MS ממספקטרומטר המסות. עבור MSI ברזולוציית מסה גבוהה על דגימה של כליה של עכבר, השתמשו ברזולוציית מסה של 60,000, במצב חיובי של 5kV, ב-1 microscan, בזמן הזרקה מקסימלי של 150 milliseconds, ובבקרת הגבר אוטומטית (AGC) פעילה. התחילו ברכישת נתוני ה-MSI, ולאחר מכן הפיקו תמונות MS מקבצי MS גולמיים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.

הקימו את מערכת הפרובה הבודדת (single-probe system) לפי ההוראות עבור MSI וכווננו את קצב זרימת הממס. שטפו את התאים המטופחים המודבקים לשקופיות הזכוכית מסוג microcover glass באמצעות PBS כדי להסיר את מצע התרבית ומרכיבי תרופה חוץ-תאיים. לאחר מכן, הניחו את שקופית הזכוכית המכילה את התאים על מערכת במה עם תנועה מוטורית בצירי XYZ לצורך הניסוי.

מקדו את הסטריאומקרוסקופ הדיגיטלי שמעל הדגימה, על קצה הגשש הבודד (single-probe), כדי לעקוב אחר חדירת התא במהלך האנליזה. השתמשו במיקרוסקופ הדיגיטלי בחיבור USB הממוקם בצד הגשש הבודד כדי לעקוב אחר תנאי העבודה של פולט ה-nanoESI שעל הגשש. השתמשו בתוכנת הבקרה של במת ה-XYZ הממונעת ובסטריאומקרוסקופ הדיגיטלי כדי לאתר תא רלוונטי ולממקם במדויק את קצה הגשש הבודד מעל הדגימה.

התחילו את רכישת נתוני ה-MS לפני השחלת קצה הפרובה הבודדת אל התא. הורידו את הפלטה המכילה את התא כדי למשוך את קצה הפרובה הבודדת החוצה מהתא. לבסוף, אפשרו לממס לזרום במשך כשלושה דקות, כדי לשטוף לחלוטין את הפרובה הבודדת.

בוצע דימות ספקטרומטריה של מסות בסביבה נקייה (ambient mass spectrometry imaging) של חתכי כליה של עכבר, וניתן היה לזהות מספר רב של מולקולות הנוכחות על פני השטח של הרקמה. מופו ההתפלגות המרחבית והשפעיות היחסיות של מולקולות מרובות על פני השטח של הרקמה. רזולוציה מרחבית של 8.5 microns הושגה באמצעות תצפיות במעברים חדים של מאפיינים הנוכחים בנתוני הספקטרומטריה של המסות.

ייצור הגשש הבודד בעל קצה חד ותעלות פתוחות הוא קריטי לאנליזה של תא בודד. מיקרוסקופים נחוצים כדי לאתר את תאי המטרה ולנטר את תהליך החדירה לתא. שינוי האות מספקטרה של מסות מספק מידע נוסף לאישור החדירה לתא.

מספר רב של מולקולות זוהו מתאים בודדים חיים. כאשר נעשה שימוש בניסויים אלו למחקר תרופות נגד סרטן, משתמשים בניסויי תאי בקרה כדי להראות את ההבדל הנובע מהטיפול בתרופה נגד הסרטן. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מיוצרת הפרובה הבודדת (single-probe), וכיצד מכשיר זה משמש לאנליזה של תא בודד באמצעות ספקטרומטריית מסות, ולדימיון מסות סביבתי (ambient mass spectrometry imaging) של רקמות ביולוגיות.

באופן כללי, אנשים המתנסים בשיטה זו בפעם הראשונה עשויים להתקשות, כיוון שנדרשות הוראות מפורטות כדי לייצר את התקן בעל הגשש הבודד, להקים את המערכת כולה ולהפעיל את המכשירים. לאחר השליטה בשיטה, ניתן לבצע ניתוח של תאים בודדים באופן רצף עבור תאים רבים. כל ניתוח נמשך פחות משלוש דקות.

סיום ניסוי של דימוי MS בסביבה רגילה עשוי להימשך מספר שעות, בהתאם לגודל הדגימה, הרזולוציה המרחבית והספקטרומטר למסות שבו נעשה שימוש. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי ייצור של גשש בודד באיכות גבוהה הוא השלב המכריע. בנוסף, כיוון ותפעול המכשיר הם קריטיים להצלחת הניסוי.

ניתן לפתח שיטות אחרות בהתאם לנהלים דומים לאלו המוצגים כאן. לדוגמה, ניתן להוסיף ריאגנטים לממס הדגימה ולבצע אנליזה ריאקטיבית של תא בודד ו-MSI בתנאי סביבה כדי לשפר את הגילוי של מולקולות מהדגימות. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים הן בניתוח תאים בודדים והן במחקרי דימיון בספקטרומטריית מסות בתנאי סביבה.

ניתן להשתמש בטכניקה זו פוטנציאלית למחקרי ביולוגיה של התא, לימודי פרמקולוגיה ולבדיקות קליניות. יש לזכור כי עבודה עם קפילרות קוורץ חדות ואפוקסי המתקשח תחת UV עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון חבישת כפפות והרכבת משקפי מגן ל-UV בעת ביצוע הליך זה.