Le séquençage profond impartiale de l'ARN virus à partir d'échantillons cliniques

L’objectif global de cette procédure est de préparer des banques de séquençage de virus à ARN directement à partir d’échantillons cliniques afin de permettre la surveillance virale et les études évolutives. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans les domaines de la génomique virale et de l’évolution, telles que la façon dont les virus à ARN mutent à l’intérieur et entre les hôtes et comment ils se propagent au sein d’une population. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est impartiale.

Il ne nécessite aucune connaissance préalable de la séquence virale pour la préparation de la banque et peut être utilisé pour séquencer n’importe quel virus. Les implications de cette technique s’étendent à la détection et à la lutte contre les maladies virales comme la fièvre de Lassa, car les diagnostics et les traitements que nous développons reposent fondamentalement sur la séquence du génome du virus. Adrianne Gladden fera la démonstration de l’épuisement sélectif.

Sarah Winnicki fera la démonstration de la synthèse de l’ADNC. Et la démonstration de la construction d’une bibliothèque d’ADN sera Dolo Nosamiefan. Pour commencer, préparez des tampons d’hybridation 5X et de réaction de la RNase H 10X dans de l’eau exempte de nucléases avec un support linéaire d’acrylamide, comme décrit dans le tableau un du protocole de texte.

Dans une plaque de PCR à 96 puits dans un bloc métallique sur glace, mettre en place la réaction d’hybridation en combinant des oligos et oligo(dT)s de déplétion de l’ARN viral et de l’ARN ribosomique précédemment extraits et traités par la DNase. Notez que toutes les réactions de ce protocole sont préparées et distribuées dans des tubes à bandelettes pour une utilisation avec une pipette multicanaux. Agitez doucement et soigneusement la réaction, puis centrifugez à 280 fois g et à température ambiante pendant une minute.

Incuber à 95 degrés Celsius pendant deux minutes, puis descendre lentement à 45 degrés Celsius à moins 0,1 degré Celsius par seconde. Mettez ensuite le thermocycleur en pause à 45 degrés Celsius. Mettez en place un mélange réactionnel RNase H dans un bloc métallique sur de la glace, puis préchauffez la solution à 45 degrés Celsius pendant deux minutes.

Avec la plaque de 96 puits encore dans le thermocycleur à 45 degrés Celsius, ajoutez le mélange RNase H préchauffé à la réaction d’hybridation. Mélangez bien en pipetant doucement six à huit fois, puis incubez à 45 degrés Celsius pendant encore 30 minutes avant de placer sur de la glace. Ensuite, configurez le mélange réactionnel DNase dans un bloc métallique sur de la glace comme décrit dans le tableau un du protocole texte.

Ajouter le mélange à la réaction de la RNase H dans la plaque. Agitez doucement et soigneusement, puis centrifugez à 280 fois g et à température ambiante pendant une minute. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis ajouter cinq microlitres d’EDTA à 0,5 molaire pour arrêter la réaction.

Après avoir doucement et soigneusement vortex la plaque, centrifugez-la à 280 fois g et à température ambiante pendant une minute. Utilisez un volume de 1,8 fois de billes d’ARN pour nettoyer la réaction selon la suggestion du fabricant, et éluez dans 11 microlitres d’eau sans nucléases. Conservez les échantillons d’ARN appauvri à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit.

Des précautions particulières doivent être prises à cette étape, car il pourrait y avoir perte ou dégradation de l’échantillon. Pour réaliser la synthèse de l’ADNC, dans une plaque de PCR de 96 puits dans un bloc métallique sur de la glace mélange d’ARN ribosomique porteur d’ARN appauvri avec des amorces aléatoires selon le protocole de texte. Après avoir doucement tourbillonné et fait tourner la plaque, dans un thermocycleur, chauffez le mélange à 70 degrés Celsius pendant dix minutes.

Immédiatement après la dénaturation thermique, placez l’ARN dans un bloc métallique sur de la glace pendant une à cinq minutes. Ensuite, après avoir préparé le premier mélange réactionnel de synthèse de brins, ajoutez-le au mélange d’amorces aléatoires d’ARN dans la plaque. Ensuite, en suivant le vortex et la centrifugeuse, incubez à 22 à 25 degrés Celsius pendant dix minutes.

Incuber la plaque à 55 degrés Celsius dans un incubateur d’air pendant 60 minutes. Placez ensuite la plaque dans un bloc métallique sur de la glace pour terminer la réaction. Maintenant, mettez en place le deuxième mélange de réaction de synthèse de brins et ajoutez-le à la première réaction de synthèse de brins dans la plaque.

Après avoir vortex et tourné comme précédemment, incubez la réaction à 16 degrés Celsius pendant deux heures. Placez la plaque dans un bloc métallique sur de la glace puis inactivez la réaction en ajoutant cinq microlitres d’EDTA 0,5 molaire avant de mélanger et de tourner comme précédemment. Avec un volume de 1,8 fois plus de billes d’ADN, nettoyez la réaction et utilisez neuf microlitres de tampon d’élution ou EB pour éluer les échantillons.

Gardez un microlitre pour la quantification. Pour un stockage au froid en toute sécurité, conservez l’ADNC double brin à 4 degrés Celsius pendant la nuit ou à moins 20 degrés Celsius pour un stockage à long terme. Pour construire une banque d’ADN, transférez quatre microlitres d’ADNC sur une plaque à 96 puits et conservez l’ARNC restant pour une deuxième tentative de détection si nécessaire.

Lorsque vous travaillez dans un bloc métallique sur de la glace, configurez la réaction de marquage comme décrit dans le tableau un du protocole de texte. Ajoutez ensuite le mélange au CDNA dans la plaque à 96 puits. Après avoir tourbillonné et essoré, incubez la plaque à 55 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis maintenez-la à 10 degrés Celsius.

Une fois à 10 degrés Celsius, ajoutez immédiatement 2,5 microlitres de tampon d’étiquetage neutralisé pour mettre fin à la réaction. Après avoir centrifugé la plaque à 280 fois g et à température ambiante pendant une minute, incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Configurez maintenant la réaction d’amplification de la PCR dans un bloc métallique sur de la glace comme décrit dans le protocole texte.

Après avoir tourbillonné et fait tourner la plaque, effectuez une PCR. Pour préparer la bibliothèque, utilisez EB pour amener les échantillons à 50 microlitres. À l’aide d’un volume de 0,6 fois plus de billes d’ADN, nettoyez la réaction et éluez 15 microlitres d’EB. Regroupez les banques à la plus faible concentration molaire d’une nanomolaire ou plus.

Si la bibliothèque est inférieure à une nanomolaire, ajoutez un petit volume de bibliothèque à la piscine. Enfin, utilisez un volume de 0,7 fois de billes d’ADN pour nettoyer la piscine comme indiqué plus tôt dans la vidéo, puis utilisez 15 microlitres d’EB pour éluer les échantillons. Analysez selon le protocole texte.

Comme le montre ici, le protocole décrit dans cette vidéo a enrichi au moins cinq fois le contenu unique du virus de Lassa dans tous les échantillons avec au moins un million de copies de l’ARN ribosomique 18S. Ce graphique illustre l’appauvrissement des séquences d’homopolymères réduits en poly(rA)porteurs de A et T dans les banques, entraîne des préparations plus propres et garantit des lectures de séquençage de meilleure qualité. Enfin, cette figure démontre que les banques finales d’échantillons cliniques viraux à faible apport ont souvent un large plan de fragment de 150 à 1000 paires de bases.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois jours si elle est correctement exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que la plupart des échantillons cliniques contiennent très peu d’acide nucléique. Par conséquent, la perte d’échantillons, la contamination et la dégradation de l’ARN sont courantes.

Après cette procédure, d’autres méthodes telles que la recherche d’ARN peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que la réponse de l’hôte à l’infection virale. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la surveillance virale pour retracer les voies de transmission de virus comme Ebola et Lassa, et d’autres agents pathogènes en circulation en Afrique de l’Ouest. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des banques de séquençage de virus à ARN directement à partir d’échantillons cliniques, permettant ainsi la surveillance virale et les études évolutives.

N’oubliez pas que travailler avec des agents pathogènes viraux peut être extrêmement dangereux. Des précautions telles que l’utilisation de l’équipement de protection individuelle approprié et des réglementations sur le niveau de biosécurité doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.