用于研究与人类衰老相关疾病基因的转基因小鼠表型分析方案

本检测方案的总体目标是建立一系列简单测试，可作为初步表型分析流程，用于指导后续对行为表型以及组织结构与功能的深入研究。通过该流程可判断人类疾病的行为学和细胞表型是否在小鼠模型中得到重现。该技术的主要优势在于，即使在无相关实验经验的实验室中，无需大量投入即可开展这些测试，且测试结果仍可为后续更深入的研究提供重要信息。

从出生后第4天至第10天，每天进行后肢测试，以评估后肢近端肌肉的力量、无力程度及疲劳情况。开始前，先让小鼠在测试区域适应30分钟。在此期间，用70%乙醇清洗一个新的500毫升锥形管，并在管底塞入一至两个棉球。

将试管垂直固定以进行测试。未进行测试时，将幼崽与母鼠放在一起以维持其体温。经过半小时的适应后，从笼中取出一只幼崽并记录其体重。

然后轻轻抓住新生幼鼠的后肢，将其悬挂在试管边缘，使幼鼠朝向棉球。记录幼鼠的拉拽尝试次数，并测量其坠落的潜伏期。等待30秒后，重复该测试。

第二次测试后，用记号笔标记幼鼠。然后用来自原笼的垫料轻轻擦拭幼鼠，并将其放回母鼠身边。由于较年长的P8幼鼠无法用记号笔标记，需通过脚趾剪切进行识别。

在处理下一只仔鼠之前，用70%乙醇擦拭试管。从出生后第19天（P19）至第21天（P21）每天进行断乳期观察试验，以评估小鼠的运动能力和总体活动水平。首先让小鼠在测试区域适应环境30分钟。

在幼崽适应环境的同时，准备实验区域。用一个六乘六的两英寸方格网格标记有机玻璃测试箱。使用前，用70%乙醇清洁测试箱。

然后将摄像机定位，使整个盒子的侧面视图充满视野。标准化周围环境的外观，以避免引入新奇因素。测试前，将断奶幼鼠转移至干净的暂养杯中，并记录其体重。

然后开始视频录制。首先，拍摄一张测试识别卡，显示小鼠的编号、年龄和当前日期。随后将小鼠从放置杯中转移至中心方格。

持续三分钟，记录两只前爪共同跨越的线条数量。三分钟后，将小鼠放回清洁的笼子，并结束视频录制。每次测试之间，用70%乙醇清洁实验箱。

从视频中统计小鼠的直立行为次数，即小鼠以前肢完全离开支撑面直立站立的行为。同时统计理毛行为次数，即小鼠以前肢进行清洁的动作。在 P22 至 P26 期间的间隔日进行握力测试，以评估神经肌肉力量。

通常情况下，让小鼠适应测试区域 30 分钟。测试装置为一个带有金属网栅的有机玻璃箱。使用 70% 乙醇对两者进行清洁。

然后用一层气泡膜铺满盒子底部作为缓冲，并在气泡膜上覆盖纸张以吸收排泄物。接着将待测小鼠分开，分别装入独立的杯子中。现在，将第一只小鼠放置在金属丝网的中央，缓慢翻转金属丝网，使其位于盒子柔软表面以上10至20厘米处。

记录小鼠跌落的潜伏期，如果小鼠在60秒内未跌落，则在60秒时结束测试。随后将第一只小鼠放回饲养杯中。每次测试之间，用70%乙醇擦拭网格，并更换气泡膜上的纸张。

然后对组内的另外两只小鼠进行测试。每只小鼠完成一次测试后，重复该过程两次，使每只小鼠共进行三次试验。如果每组小鼠少于三只，需确保每次试验之间至少有五分钟的恢复时间。

进行NADH脱氢酶染色时，将新配制的NADH溶液与新配制的NBT溶液等体积混合。然后向每张载玻片加入一毫升染色液，将载玻片置于湿润 chamber 中，在37摄氏度下孵育30分钟。进行琥珀酸脱氢酶染色时，配制含有0.1摩尔琥珀酸钠、1.25摩尔NBT和0.2摩尔磷酸盐缓冲液的溶液。

然后向每张载玻片加入一毫升溶液。将载玻片放入湿盒中，在37摄氏度下孵育一小时。染色孵育结束后，吸去染色液，并用蒸馏水洗涤载玻片三次。

然后将载玻片依次浸入浓度递增和递减的丙酮溶液中进行洗涤。每种浓度的丙酮溶液均洗涤三次，每次两分钟。最后用蒸馏水冲洗载玻片三次。

然后使用水性封片剂封片。采用所述的一系列测试方法检测无 HTRA2 表达的小鼠，并与同窝对照小鼠进行比较。在出生后第4天至第6天之间，未观察到拉力次数或跌落潜伏期的变化；而在出生后第7天至第10天之间，发现神经肌肉力量有所下降。

在活动能力测试中，HTRA2基因敲除小鼠表现出活动能力下降。在金属网抓握力测试中，HTRA2基因敲除小鼠也显示出力量减弱。H和E染色结果显示，在P35时，HTRA2基因敲除小鼠的视网膜结构与对照组相比无明显改变。

最后，通过电子传递链复合物活性的组织化学染色来检测呼吸酶功能的变化。与对照组相比，HTRA2基因敲除小鼠的染色强度降低，这种变化在小脑和纹状体中可见，但在皮层中未观察到。

观看本视频后，您应能充分了解如何评估基因修饰小鼠的活动能力与神经肌肉力量，以及如何将这些研究与细胞轴向分析相结合。感谢观看，祝您的实验顺利。