人体血液中测粒及单核细胞吞噬功能和呼吸爆发活动

该测定的总体目标是测量全血中的粒细胞和单核细胞吞噬作用以及氧化爆发活性。这种方法可以帮助回答免疫学领域的关键问题，例如特定的饮食干预如何影响对运动的免疫反应。该技术的主要优点是它是一种简单、直接的检测方法，可以很容易地进行修改，以适应可用的实验室资源和研究兴趣。

在过去的二十年里，我们一直在许多运动试验中使用这种先天免疫功能的测量方法，我们将在视频后面分享其中的一些数据。在开始程序之前，根据制造商的说明，使用血液分析仪对血液样本进行全血细胞计数和白细胞鉴别分析。记下每毫升细胞数的白细胞计数以及样品的中性粒细胞和单核细胞百分比值。

然后，对于每个实验管和对照管，使用加长移液器吸头将 100 μL 每个全血样品从肝素锂采血管转移到适当标记的 12 x 75 毫米管的底部。转移完所有血液后，将 10 微升 HE 工作溶液添加到标有红色墨水和 H 的试管中，包括 HE 对照管。打开试管的盖子。

短暂涡旋样品，然后将试管转移到 37 摄氏度的水浴中，放在开放式金属架上，每 5 分钟轻轻摇晃一次。15 分钟后，将试管架和试管快速转移到冰水浴中 12 分钟，每 5 分钟轻轻摇晃一次。孵育结束时，将适当体积的未标记的金黄色葡萄球菌工作溶液添加到用红色墨水和 H 标记的试管中，包括 HE 对照管。

用盖子短暂涡旋试管。然后将适当体积的 FITC 标记的金黄色葡萄球菌工作溶液添加到用黑色墨水和 F 标记的试管中，包括 FITC 对照管，并短暂涡旋样品。接下来，将所有试管在 37 摄氏度的水浴中孵育 20 分钟，每 5 分钟摇晃一次，然后在冰水中冷却 1 分钟。

将样品置于室温下后，使用连续移液管向所有试管中加入 100 微升冰冷淬灭溶液并涡旋样品。将样品放回冰浴中。一分钟后，使用连续移液管向每个试管中加入一毫米冰冷的 PBS。

然后涡旋试管并向样品中再添加 2 毫升 PBS。现在离心细胞并吸出上清液。使用连续移液管，向试管中加入 50 微升冰冷的 FBS。

涡旋后，将所有试管转移到转盘上。使用自动细胞裂解制备工作站裂解红细胞，并根据制造商的说明固定白细胞。要通过流式细胞术分析检测结果，请打开流式细胞术系统采集软件并创建一个新方案。

选择 FITC 作为吞噬作用测定的 FL1 参数，选择 HE 作为氧化爆发活性测定的 FL2 参数。创建前向与侧向散点图、FL1 直方图和 FL2 直方图。然后在正向与侧向散点图上为白细胞、粒细胞和单核细胞群创建多边形区域，并在直方图上创建线性区域。

现在运行仅血液阴性对照样品，然后运行 HE 和 FITC 阳性对照样品，查看直方图并根据需要调整 FITC 和 PE 通道的光电倍增管电压。然后开始对对照样品进行数据采集。平衡期 15 分钟后，根据工作列表上的顺序将实验样品加载到转盘中，并进行研究样品分析。

为了评估样品的吞噬活性，首先将所有 F 标记的样品和对照列表模式数据文件合并到一个文件夹中，然后将文件拖到流式细胞术分析软件的样品空间中。双击对照样品，并使用多边形门选择器为总白细胞群设置门，注意在图表边缘包括所有细胞。将此门标记为 WBC。

双击 WBC 门，并使用椭圆门选择器设置淋巴细胞门。相应地标记门并将门数据百分比拖动到一侧，以便轻松查看单元格。然后使用多边形门选择器设置粒细胞门和单核细胞门。

相应地标记每个门，并将门数据百分比拖动到一侧。双击 FITC 对照样品，然后双击粒细胞门，然后使用下拉菜单将 X 轴设置为 FL1，将 Y 轴设置为侧向散射或 SS。使用方形门选择器设置吞噬负门和吞噬正门。突出显示粒细胞群的吞噬作用阳性门。

然后单击 工作区 和 添加统计数据。突出显示 Geometric Mean 和 FL1 以生成吞噬作用阳性粒细胞的荧光强度，然后单击 Add。然后选择父统计数据的频率，然后单击 Add 以生成吞噬作用阳性的粒细胞的百分比。

要将这些设置应用于所有研究样本，请突出显示在 FITC 对照样本中创建的所有门和统计量，然后将它们拖动到组面板的 All Samples 区域中。将作品另存为 WSP 文件，该文件夹与包含 list mode 数据文件夹的文件夹相同。现在单击数据集中的第一个实验样品，并确认白细胞门适当地拟合每个样品上的细胞分布，并根据需要调整门的边缘。

现在单击第一个实验样品中的白细胞门，确认粒细胞、单核细胞和淋巴细胞门适合每个样品上的细胞分布，并根据需要调整门。保存文件后，单击表编辑器图标，然后将每个感兴趣的统计信息拖动到表中。单击 Create Table 以电子表格格式显示数据并将工作另存为 XLSX 文件。

然后对 H 标记的氧化爆发活性样品和控制列表模式数据文件重复分析，如刚才所示。正如这个代表性实验所证明的，粒细胞介导的金黄色葡萄球菌吞噬作用在 75 公里骑行后立即增加，并在第二天早上恢复正常。在此活性水平后至少 21 小时内，粒细胞氧化爆发活性降低。

此外，粒细胞吞噬作用与血清 C 反应蛋白水平之间存在适度的相关性，如对 106 名超重或肥胖女性的分析所观察到的那样，表明静息受试者的高粒细胞和单核细胞吞噬作用可能表明全身性炎症。一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在 7 小时内完成大约 30 个样品。在尝试此程序时，请务必记住在添加细菌之前将样品完全冷却，以帮助最大限度地减少任何无法解释的样品间差异。

在此程序之后，可以执行其他方法，如细胞因子定量，以确定您的干预对炎症反应的影响。该技术发展后，为免疫学领域的研究人员探索各种生活方式改变和人类先天免疫功能的影响铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何使用流式细胞仪测量粒细胞和单核细胞吞噬作用以及氧化爆发活性有很好的了解。

不要忘记，处理人血可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴适当的个人防护装备。