Name: Die anionische Polymerisation eines amphiphilen Copolymer zur Herstellung von Blockcopolymermicellen Stabilisiert durch π-π-Stapelwechselwirkungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Erfahren Sie die anionische Ringöffnungspolymerisation zur Synthese von Blockcopolymeren für die Arzneistofffreisetzung. Diese Methode ermöglicht die Herstellung von Mizellen mit kontrollierter Doxorubicin-Freigabe über vier Tage.

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CA bestätigt einen Discovery-Zuschuss des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. CA erhält einen Lehrstuhl für Pharmaceutics and Drug Delivery von GSK. Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

<img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54422/54422fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische die neun wichtigsten Schritte bei der Herstellung des MPEG- b -PPheGE Copolymer zeigt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54422/54422fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54422/54422fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 1. Herstellung der Reagenzien unter trockenen Bedingungen <ol><li> Herstellung der Reagenzien. <ol><li> Wiegen 15 g mPEG-5K (M n = 5.400 g / mol, PDI 1,03) und bei 50 ° C in einem Ofen unter Vakuum für 48 Stunden vor der Verwendung. </li><li> Dry 200 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) über Calciumhydrid (CaH 2) (~ 1 g), unter Vakuum für 30 min, Spülung unter Argon und unter Rühren für 48 Stunden vor der Verwendung. </li><li> Legen Sie 50 ml des PheGE Monomer in einem trockenen und sauberen Kolben (100 ml), fügen Sie 1 g CaH 2, Dichtung unter Vakuum für 15 Minuten auf Eis, Säuberung unter Argonund lassen Sie für 24 Stunden unter Argon vor der Verwendung zu rühren. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung des Kaliumnaphthalin <ol><li> Vorsichtig schneiden kleine Stücke Natrium (~ 1,5 g) mit Hexan getrocknet überschüssigem Mineralöl zu entfernen und in den Rundkolben, der Tetrahydrofuran (THF) (V = 500 ml), die hinzuzufügen. HINWEIS: Die Stücke von Natrium darf nicht für lange der Luft ausgesetzt werden, wegen Brandgefahr. </li><li> In Benzophenon (~ 5 g), Spülung mit Argon und dichten den Rundkolben (2 Hälse) mit Glasstopfen. </li><li> Nach Rühren unter Argon 24 h, schließen Sie den Rundkolben in eine Destillationsapparatur (Abbildung 2), destillieren die dunkle Lösung unter Argon unter Rückfluß (dh Rückfluß etwa 2 Stunden Zeit , nachdem die Lösung wird blau). Beginnen Sie das gewünschte Volumen ~ 150 ml THF zu sammeln, indem Sie das linke Ventil geschlossen (in der Mitte der Destillationsapparatur gefunden). HINWEIS: Wenn diese Lösung nicht blau drehen, stoppen Sie die destillierenlation, kühlen bei Raumtemperatur (RT) nach unten und mehr Benzophenon oder Natrium und starten Sie den Destillation hinzuzufügen. Dies ist ein Indiz dafür, dass THF noch Wasser enthält. </li><li> In einem trockenen Erlenmeyerkolben mit destilliertem THF (v = 100 ml) und 3,9 g Naphthalin aufzulösen. HINWEIS: Stoppen Sie die Destillation, Kühlung bei RT nach unten und öffnen Sie das richtige Ventil das Volumen an THF zu übertragen. </li><li> mit dem Naphthalin (Endkonzentration ~ 0,3 mol / L) Wie unter Ziffer 2.1 beschrieben, schneiden kleine Stücke von Kalium (1,1 g) und zu der Lösung hinzuzufügen. Verschließen Sie den Erlenmeyer mit einem Spüladapter (T) (on / off) mit einem Septum an der Spitze und spülen mit Argon. </li><li> Nach Rühren unter Argon 24 h, beobachten die resultierende Lösung des Kaliumnaphthalin Basis als eine homogene dunkelgrüne Farbe. </li><li> Unter inerten Bedingungen, ein 5 ml-Aliquot der basischen Lösung aus dem Kolben mit Hilfe einer Spritze zu entfernen und zu 10 ml destilliertem Wasser. Anschließend fügen Sie 1-2 Tropfen Phenolphthalein-Indikator zu dieser Lösung,das wird die Lösung eine pinkfarbene Farbe. </li><li> Verwenden einer Bürette die Kaliumnaphthalin Lösung mit einer Standard-Salzsäurelösung titriert (0,1 N), bis die Lösung farblos macht. </li></ol> 3. Materialien und die notwendigen Vorsichtsmaßnahmen für eine wirksame lebende anionische Polymerisation <ol><li> System Argon / Vakuumverteiler. HINWEIS: Wie in Abbildung 2 beschrieben, wird ein Doppelglasblock mit Glashohl Absperrhähne verwendet , um zwischen Argon Lieferung und Vakuumbedingungen in den Gläsern. <ol><li> Schließen Sie den Tank von Argon (mit Manometer) zu einem trockenen Trockensäule und an der Verteilerleitung inerten Gummischlauch mit. Am anderen Ende der Argon Linie, schließen ein Sprudler (mit Mineralöl). </li><li> Um den Glas Absperrhähne verbinden flexible inerte Röhren und Nadeln. Um die andere Leitung des Verteilers, schließen Sie eine Glasfalle in einem kalten Dewar-Gefäß getaucht (gefüllt mit Eis / Wasser oder flüssigem Stickstoff) zu einer Hochvakuumpumpe. </li&gt; </ol></li><li> Vorrichtung zur Destillation von Monomeren und DMSO. HINWEIS: Eine bequeme (dh alle in einem) Vorrichtung zur Hochvakuumdestillation verwendet wird (Abbildung 2). Die trockene Glas wird mit Hochvakuumventile und Einbau-Kondensatoren mit einem inneren Kühlkopf aus. <ol><li> Verbinden Wasserströmung durch den Einlass (A) und Ausgang (B) der Kühleinheit (Buchstabe). Schließen Sie das andere Ein- / Ausgang (C) zum dualen Verteiler für Argon / Vakuum. Hinzufügen und Dichtung ein Septum (Metalldrähte) bei der Lieferung / Entnahmeöffnung und schließen Sie eine Kanüle aus rostfreiem Stahl für die Übertragung von Luft empfindliche Flüssigkeiten (D) (Oben / Schleife). </li><li> Vor der Polymerisation abzudestillieren PheGE und DMSO auf halbkugeligen Heizmäntel bei 100 ° C und 70 ° C, jeweils für 2 Stunden unter Vakuum unter Rühren. Der Siedepunkt des PheGE Monomer beträgt 254 ° C, während der Siedepunkt für DMSO beträgt 189 ° C bei (1 atm). </li></ol></li><li> Glaswaren für anionische polymerizatIon. <ol><li> Zusätzlich zu dem Destillationssystem, verwenden Sie nur Hochvakuum beständige Glaswaren einschließlich Rundkolben (vom Hersteller zertifiziert), Messzylinder (für die Übertragung von Volumina Lösungsmittel, Base und Monomere), Kanülen, Septen und Metalldrähte der Septen zu versiegeln. HINWEIS: Für lebende Polymerisation, Wärme sorgfältig (unter Vakuum) und abkühlen alle Gläser unter Argon-Strom vor der Verwendung. Halten Sie die Heißluftpistole in einem Abstand ~ 10 cm von der Glaswaren. </li></ol></li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54422/54422fig2.jpg" /> Abbildung 2. Montage und Schlüssel Destillation / Transferschritte. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54422/54422fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54422/54422fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 4. Beschreibung der wichtigsten Schritte der Lebens- anionische Polymerisation: Destillation und Übertragung <ol><li> Wiegen mPEG-5K (2 mmol, 10 g) in einer trockenen flask / Schlenk (Backofen), die einen Rührstab und dichten den Spüladapter (T) (on / off) mit einem Septum an der Spitze. </li><li> Der Kolben wird an den Verteiler und zu spülen, Kolben für 2-3 min mit Argon spült. Drehen das Ventil in die Vakuumstellung den Kolben zu spülen. </li><li> Drehen Sie den Kolben von Hand und trocknen Sie das Reaktionsgefäß homogen mit einem Fön (Heißluftfön) bis mPEG-5K schmilzt. HINWEIS: Halten Sie die Heißluftpistole in einem Abstand ~ 10 cm aus dem Kolben. </li><li> Nach 1 min, das Vakuum brechen, indem Sie das Ventil auf dem Verteiler in Richtung der Argon Position mit mehreren schnellen Schnappschüsse drehen. HINWEIS: Eine kontinuierliche Argonstrom hat in Wäscher zu beobachten. Wenn die Strömung kontinuierlich ist, bleibt das Ventil auf der Argonposition. Wiederholen Heiz- und Kühlschritte zweimal alle Spuren von Feuchtigkeit zu entfernen. </li><li> Halten Sie das polymere Makroinitiator unter Vakuum für ~ 2 h und unter Argon, bevor die Reaktion beginnt. </li><li> Berg zwei Hochvakuumdestillationsvorrichtungen unter der Haube (Abbure 2); eine für die Destillation von DMSO und eine für die Destillation des Monomers (PheGE). </li><li> Verbinden der separaten Kolben, die das DMSO und Monomer zu den beiden Vorrichtungen und installieren jeweils auf einem halbkugeligen Heizmantel (oder in einem Ölbad). Schließen Sie kaltes Wasser an die Spitze der Vorrichtung (in / out) und dem Verteiler (Argon / Vakuum). </li><li> Stellen Sie sicher, dass jedes Gerät sicher und gut verschlossen. Engage das Vakuum über das Ventil. . HINWEIS: Wie in Schritt 3.3 beschrieben, wiederholen Heiz- und Kühlschritte zweimal alle Spuren von Feuchtigkeit zu entfernen. </li><li> Stellen Sie die Heizung über einen Temperaturregler und starten Sie die Lösungen gerührt wurde. Nach 2 Stunden der Zirkulation / Destillation von DMSO, schließen Sie das Hochvakuumventil (in der Mitte der Destillationsapparatur gefunden) etwa 20 ml Lösung zu sammeln (das Innere der Vorrichtung zu waschen). Dann lassen Sie den Anteil in den Kolben und wiederholen Sie den Vorgang noch einmal die Reinheit der gewünschten Fraktion, um sicherzustellen, dass cspäter ollected. </li><li> Heizen Sie den Kolben, der das mPEG-5K (unter Vakuum) mit dem Heißluftfön bis das Polymer (mPEG-5K) enthält, schmilzt. Spülen Sie wieder mit Argon. HINWEIS: Das Verfahren zur Auflösung nach der Übertragung des DMSO helfen. </li><li> Nach 2 Stunden, schließen Sie das Volumen des Lösungsmittels (V DMSO = ~ 100 ml) , um das Hochvakuumventil und zu sammeln. Heizung ausschalten und das Vakuum brechen aus dem Verteiler. Release Argon (durch Schnappverschlüsse) in die Kammer wie oben beschrieben. </li><li> Unter einem positiven Druck von Argon (am Hahn der Vorrichtung halten) zu einem Meßzylinder einer Seite der Kanüle angeschlossen oder direkt in den Kolben die mPEG-5K, die (wenn die Destillationsvorrichtung weist Graduierung) und tauchen das andere Ende vorsichtig in die frisch destillierte Fraktion. </li><li> Verwendung von Argondruck treiben die DMSO durch die Kanüle in den Reaktionskolben. Schließen Sie einen zusätzlichen Wäscher in den Kolben (oder Zylinder, wenn für die Messung erforderlich), schließen Sie den Glashahn verbunden zu the Bubbler auf der gegenüberliegenden Seite des Verteilers. HINWEIS: Wenn eine Seite einer Kanüle für die Übertragung entfernt wird, stellen Sie sicher, dass die positiven Argondruck angelegt wird. </li><li> Zur Vermeidung von Unfällen durch Argondruck verursacht, öffnen Sie das Glashahn für 1-2 sec und wieder schließen, den Fluss von DMSO, um fortzufahren (wiederholt einmal pro 0,5 min) bis zur vollständigen Übertragung abgeschlossen ist. Öffnen Sie den Hahn, wenn Sie fertig. HINWEIS: Das gleiche Verfahren ist nun für die Destillation und Sammlung des Monomers folgen. Das Lösungsmittel und das Monomer kann nicht zur gleichen Zeit gesammelt werden. </li><li> Transfer 5 ml von 0,3 M Kalium-Naphthalin über Kanülierung in einem Meßzylinder durch ein Septum mit Kanüle eingeführt abgedichtet (loop). HINWEIS: Der gleiche Vorsichtsmaßnahme, wie in Anmerkung 4.13 beschrieben. Positivem Argondruck muß zuerst aus dem Naphthalin Kalium Kolben auf den Zylinder und dann von dem Zylinder in den Reaktionskolben aufrechterhalten werden, Luft / Wasser-Verunreinigung zu vermeiden. </li><li> Legen Sie eine andere Nadel aus dem manifold in den Zylinder (Argon). Entfernen Sie die Kanüle in das Destillationssystem verbunden sorgfältig und schnell in den Reaktionskolben ein. HINWEIS: Verwenden Sie diese Technik für die Übertragung von Basis und Monomer. </li><li> Fügen Sie den Basistropfen, bis die Lösung dunkel wird. Nach dem langsamen Verschwinden der Farbe, fügen Sie einen anderen Teil, bis die dunkle Farbe wieder erscheint, und wiederholen, bis die vollständige Übertragung. </li><li> Übertragen , um das gewünschte Volumen an Monomer (V PheGE = 5 ml) mit einem Polymerisationsgrad von PPheGE ~ n = 18-20 zu erreichen. </li><li> Verlassen die Reaktion für 48 h bei 80 ° C unter einer Argonatmosphäre unter ständigem Rühren eine vollständige Polymerisation sicherzustellen. </li><li> Quenche die Reaktion durch die Zugabe von Tropfen von HCl 1 N in Methanol (gemessen mittels Lackmuspapier (neutraler pH)), und durch eine Farb Verschwinden beobachtet. </li><li> Extrahieren das Naphthalin aus der DMSO-Lösung mit Hexan (3 × 50 ml). Entfernen Sie die DMSO durch Destillation unter Vakuum ~ 70 ml (gleiche Vorrichtung). Gurrenl auf der Slurry-Lösung und 50 ml THF hinzu. </li><li> Entfernen des Salzes aus der Aufschlämmung Lösung durch Zentrifugation bei 5.000 xg für 10 min. Den Überstand und fügen tropfenweise zu 500 ml kaltem Diethylether. </li><li> Der Niederschlag wird durch Filtration oder Zentrifugation (zweimal wiederholen) und trocken unter Vakuum bei 30 ° C für 24-48 h (Ausbeute 85%). HINWEIS: Das Copolymer nun bereit für die Charakterisierung ist. </li></ol> 5. Charakterisierung der Copolymere <ol><li> Wiegen 5-10 mg Copolymer (Aufzeichnung der tatsächlichen Masse) in einem Aluminiumprobenschale und Dichtung hermetisch mit dem Aluminiumdeckel. Lastprobenschale und Referenzpfanne (leer) in das Differential-Scanning-Kalorimeter. </li><li> Programm ein Verfahren ( &quot;Heizen / Kühlen / Heizen&quot;) Zyklus: 1) Wärme von 40 ° C bis 100 ° C bei 10 ° C / min, 2) Abkühlen auf -70 ° C bei 10 ° C / min, 3) Wärme bis 100 ° C bei 10 ° C / min. Wiederholen 2) und 3) zweimal. Bestimmen Sie Schmelzpunkt (T m), Kriallization (T c) und Glasübergangstemperaturen (Tg) und Schmelzwärme (&amp; Delta; H f) von den thermischen Spuren aus dem dritten Zyklus (falls zutreffend). </li><li> Auflösen der Polymere in THF (2 mg / ml) und filtriert durch ein 0,2-um-PTFE-Filter. Injizieren der Probe in einer Gel - Permeations - Chromatographie - System (50 ul) und verwenden , um die Retentionszeit für die Probe und eine Kalibrierungskurve erzeugt eine Reihe von Polystyrol - Standards mit dem Molekulargewicht des Polymers zu bestimmen. 19 </li><li> Man löst die (Co) polymerisate (15 mg / ml) in DMSO d 6 1 H - NMR - Spektroskopie - Analyse. 19 </li><li> Bestimmung der kritischen Mizellenkonzentration (CMC) des Copolymers unter Verwendung von 1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatrien (DPH) als Fluoreszenzsonde. 9 <ol><li> Bereiten Sie eine DPH-Stammlösung in THF (2,32 mg / l) im Dunkeln und mit 100 ul dieser Stammlösung zu jeder einer Reihe von Vials. </li><li> Prepare einem Copolymer-Stammlösung in THF und fügen Aliquots gleichen Volumens (2 ml) zu der Reihe von Ampullen (jeweils ein Aliquot der Stammlösung, die DPH), was zu Endcopolymer Konzentrationen, die von 0,01 bis 1.000 &amp; mgr; g Copolymer / ml liegen. </li><li> Anschließend Wirbel das Copolymer-DPH-Lösungen und tropfenweise zu 10 ml doppelt destilliertem Wasser mit Rührstab. Die Lösungen müssen dann 48 h unter einem Stickstoffstrom kräftig im Dunkeln gerührt werden langsame Verdampfung von THF zu ermöglichen. Die Endkonzentration von DPH in jeder Lösung ist 0,232 mg / L. </li><li> Messen Sie die Fluoreszenzemission der Proben bei 430 nm (λ ex = 350 nm) mit einem Dual-Scan - Mikro Spectrofluorometer und Plot - Fluoreszenz unter Verwendung gegen log [Polymer]. Der Schnittpunkt zwischen den beiden linearen Steigungen bietet die CMC-Wert für das Copolymer. </li></ol></li></ol> 6. Verfahren für Doxorubicin in BCMs Laden <ol><li> Man löst 12 mg DOX in 1 ml aceacetonitril, mit 10 ul Triethylamin und lassen Sie die Lösung unter Rühren im Dunkeln für 2 Stunden. </li><li> Man löst das Copolymer (45 mg) in 1 ml THF und rührt für den gleichen Zeitraum. Fügen Sie die Copolymer-Lösung der DOX-Lösung und spülen Sie das Fläschchen Rest-Copolymer mit einem zusätzlichen Volumen von THF enthält (0,5 ml). </li><li> Fügen Sie die Copolymer-Wirkstoff-Mischung (2,5 ml) tropfenweise zu einer Phiole (20 ml) mit 15 ml Kochsalzlösung 0,9% (NaCl) unter Rühren. </li><li> Die Lösung wird in einen Dialysebeutel (3,5 kDa abgeschnitten) und dialysiert gegen Kochsalzlösung 0,9% (500 ml). HINWEIS: Ändern Sie den externen Salz nach 6 Stunden und lassen Sie die Dialyse für 24 Stunden weiter im Dunkeln bei RT unter Rühren. </li><li> Übertragen, das Dialysat auf eine 50 ml-Röhrchen und zentrifugiert bei 5.000 xg für 15 min. </li><li> Den Überstand auf einer Ultrafiltrationsanlage (mit einer 10 ml Fassungsvermögen), die eine Dialysemembran enthält (cut off 10 kDa). Setzen Sie das Rühren Adapter in das Ultrafiltrationssystem, den Deckel schließen und öffnen alstream Stickstoff. </li><li> Konzentriere das BCM-Lösung auf ein Volumen von 4 ml und 6 ml der frischen Kochsalzlösung und zweimal wiederholen den Vorgang. </li><li> Konzentriere die BCM-Lösung auf 4 ml, spülen Sie die Kammer mit 0,5 ml Kochsalzlösung und zu der Lösung. Shop in braunen Fläschchen bei RT im Dunkeln vor der weiteren Verwendung. </li></ol> 7. Bewertung von Doxorubicin Laden in DOX-BCMs <ol><li> Man löst DOX-BCM in Dimethylformamid (100 ul in 400 ul), um die Mizellen stören und verdünnen in HCl-Lösung (0,1 N) vor der Auswertung (100 ul in 900 ul HCl 0,1 N). </li><li> Messen Sie Wirkstoffbeladung bei 490 nm ein Benchtop-Mikrotiterplatten spektrophotometrischen System. Verwenden Sie die folgenden Gleichungen, die die Droge Ladekapazität (DLC) und Wirkstoffbeladung Effizienz (DLE) zu bestimmen: DLC (wt%) = (Gewicht der Wirkstoff beladen / Gesamtgewicht von BCMs) x 100% DLE (%) = (Gewicht der wirkstoffbeladenen / Gewicht des Wirkstoffs in Beschickung) x 100% </li></ol> 8. Bewertungvon In - vitro - Freisetzung von DOX von DOX-BCMs <ol><li> die Freisetzung von DOX von BCMs untersuchen bei 37 ° C in 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) gegen PBS pH 7,4, enthaltend 0,1% (w / v) Tween 80, BCMs + BSA (50 mg / ml) gegen PBS pH 7,4 und 0,1 M Acetat-Puffer bei pH = 5,5. 20,21 </li><li> Verdünne die BCM-DOX-Formulierung (700 ul) in den ausgewählten Puffer (2,3 ml) in einer Gesamtmenge von ≈ 0,6-0,7 mg DOX in dem Dialysebeutel führen. </li><li> Legen Sie die Lösung in der Dialysebeutel, Siegel mit Clips und tauchen Sie den Beutel in 200 ml der jeweiligen externen Medien. </li><li> Entfernen Sie die 2 ml der Lösung außerhalb des Dialysebeutel zu vorgegebenen Zeitpunkten und ersetzen mit dem gleichen Volumen an frischem Puffer. </li><li> Speichern der bei -20 ° C entfernt Aliquots vor der Analyse durch UV-Vis - Spektrophotometrie (Abs 490 nm). Der kumulative Prozentsatz der Wirkstoff freigesetzt (E r) kann mit der folgenden Gleichung berechnet werden: <img alt= &quot;Equation1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54422 / 54422eq1.jpg&quot; /&gt; ANMERKUNG: wo m DOX die Menge an DOX in den BCMs repräsentiert, V 0 ist das Gesamtvolumen des Trennmedium (200 ml), V t ist das Volumen der ersetzten Medien (V t = 2 ml), Ci die Konzentration vor der Korrektur, und stellt C n die Konzentration von DOX in der Probe. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Aufgrund der guten Steuerung, die anionische Polymerisation über Molekulargewicht bereitstellt, ist es eines der am meisten angewandten Prozesse in der Industrie zur Herstellung von Polymeren auf Basis von Monomeren Oxiran (PEG und PPG). Optimal und stringenten Bedingungen verwendet werden muss für eine erfolgreiche Polymerisation erreicht werden. Konsequente Reinigung aller Reagenzien und geeignete Vorrichtungen sind für den lebendigen Charakter der Synthese von wesentlicher Bedeutung. Einschränkungen der aktuellen Set...

In wässrigen Medien, montieren amphiphile Blockcopolymere nano-sized Blockcopolymermicellen (BCMs), die aus einem hydrophoben Kern, der von einer hydrophilen Schale oder corona umgeben zu bilden. Der Micellkern kann für den Einbau von hydrophoben Arzneimitteln als Reservoir dienen; während der hydrophile corona stellt eine Schnittstelle zwischen dem Kern und dem äußeren Medium. Poly (ethylenglykol) (PEG) und ihre Derivate sind eine der wichtigsten Klassen von Polymeren und eines der am häufigsten in der Arzneimittelformulierung verwendet. 1-3 BCMs bewährt haben dazu einen würdigen Arzneimittelabgabeplattform zu sein mit mehreren Formulierungen angewiesen Technologie , die jetzt im späten Stadium der klinischen Entwicklung. 4 Am häufigsten wird der hydrophobe Block des Copolymers aus Polycaprolacton, Poly (D, L-lactid), Poly (propylenoxid) oder Poly (β-benzyl-L-aspartat) besteht. 5 -9 Kataoka Gruppe untersucht kugelförmige Mizellen aus PEO - b gebildet </em&gt; -PBLA Und Poly (ethylenoxid) - b -. (Polyasparaginsäure-konjugierte Doxorubicin) für die Lieferung von Doxorubicin (DOX) 10,11 In ihren Berichten stellen sie fest, dass π-π - Wechselwirkungen vorwärts zwischen dem Polymer-konjugierten Medikament oder PBLA und frei DOX wirken, um die Micellkern was zu Erhöhungen von Wirkstoffbeladung und Retention zu stabilisieren. Nachgewiesen wird , dass die Kompatibilität oder Interaktionen zwischen einem Arzneimittel und dem Kern bildenden Block sind Determinanten von Key Performance bezogenen Parameter. 12 Zusätzlich zu DOX eine Reihe von Krebstherapeutika umfassen aromatische Ringe innerhalb ihrer Kernstruktur (zB Methotrexat, olaparib, SN -38). Als Ergebnis besteht erhebliches Interesse an der Synthese von Copolymeren, die benzyl Ringe in ihren kernbildenden Blöcke aufweisen. Anionische Ringöffnungspolymerisation von PEG und seine Derivate ermöglichen die Kontrolle über das Molekulargewicht und führen in Materialien mit geringer Uneinheitlichkeit in guter Ausbeute. 13,14 Ethylene Oxid mit Phenylglycidylether (PheGE) oder Styroloxid (SO) kann (co) polymerisiert werden Blockcopolymere zu bilden , die Mizellen zur Solubilisierung von hydrophoben Arzneimitteln bilden. 15-18 Der vorliegende Bericht beschreibt die notwendigen Schritte für eine lebende anionische Polymerisation von Phenyl Glycidylether - Monomer auf mPEG-OH als Makroinitiator (Abbildung 1). Das resultierende Blockcopolymer und seine Aggregate werden dann in Bezug auf die Eigenschaften von Relevanz dadurch gekennzeichnet, Arzneimittelabgabe zu verwenden.

<table><tbody><tr><td>DMEM/HAMF12</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>12500</td><td>Ergänzt mit 10% FBS. Warm bei 37 Grad; C Wasserbad.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td>Warm in 37 μg; C Wasserbad</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td>Kanada Herkunft</td></tr><tr><td>MDA-MB-468 Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>HTB-132</td><td></td></tr><tr><td>MTS Tetrazolium Reagenz</td><td>PROMEGA</td><td>G111B</td><td></td></tr><tr><td>Phenazin Ethosulfat (PES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4544</td><td>>95%</td></tr><tr><td>mPEG5K (Mn 5.400 g/mol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81323</td><td>PDI=1,02</td></tr><tr><td>Dimethylsolfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540></td><td>99,5%</td></tr><tr><td>Naphthalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>147141</td><td>>99%</td></tr><tr><td>Phenylglycidylether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A32608</td><td>>85%</td></tr><tr><td>Benzophenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>427551</td><td>>99%</td></tr><tr><td>Kalium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>451096</td><td>>98%</td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Caledon Laborchemikalien</td><td>8900 1</td><td>ACS</td></tr><tr><td>Hexan</td><td>Caledon Laborchemikalien</td><td>5500 1</td><td>ACS</td></tr><tr><td>Calciumhydrid (CaH2)</td><td>ACP</td><td>C-0460</td><td>>99,5%</td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Caledon Laborchemikalien</td><td>1/10/4800</td><td>ACS</td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader</td><td>BioTek Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynamische Differenzkalorimetrie (DSC)</td><td>TA Instruments Inc</td><td>DSC Q100</td><td></td></tr><tr><td>Gelpermeationschromatographie (GPC)</td><td>Waters</td><td>2695 Trennform / 2414 Detektor&nbsp;</td><td>2 Säulen: Agilent Plgel 5 & micro; m Mixed-D</td></tr><tr><td>NMR-Spektroskopie</td><td>Varian Mercury 400MHz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform-d</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151858</td><td>99,96 %</td></tr><tr><td>DMSO-d</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>156914</td><td>99,96 %</td></tr><tr><td>Vakuumpumpe</td><td>Gardner Denver Welch Vacuum Tech, Inc.</td><td></td><td>Enddruck 1x10-4 Torr</td></tr><tr><td>Drierit mit Anzeige, 8 Mesh</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238988</td><td>Regeneriert bei 230&nbsp; &deg; C für 2 Std</td></tr></tbody></table>.

die anionische polymerisation eines amphiphilen copolymer zur herstellung von blockcopolymermicellen stabilisiert durch π-π-stapelwechselwirkungen

Anionic Polymerization of an Amphiphilic Copolymer for Preparation of Block Copolymer Micelles Stabilized by &#960;-&#960; Stacking Interactions

In dieser Studie wurde ein amphiphiles Copolymer , das einen Kern bildenden Block mit Phenylgruppen enthält wurde durch lebende anionische Polymerisation von Phenylglycidylether (PheGE) auf Methoxypolyethylenglykol (MPEG - b -PPheGE) synthetisiert. Charakterisierung des Copolymers ergab eine enge Molekularverteilung (PDI &lt;1,03) und bestätigt den Polymerisationsgrad von mPEG 122 - b - (PheGE) 15. Die kritische Mizellenkonzentration des Copolymers wurde unter Verwendung eines etablierten Fluoreszenzmethode mit dem Aggregationsverhalten durch dynamische Lichtstreuung, und Transmissionselektronenmikroskopie bewertet ausgewertet. Das Potential des Copolymers zur Verwendung in Drug - Delivery - Anwendungen wurde in einer vorläufigen Weise bewertet , einschließlich In - vitro - Biokompatibilität, Beladung und Freisetzung des hydrophoben Antikrebsmittel Doxorubicin (DOX). Eine stabile Mizellen Formulierung von DOX wurde mit Wirkstoffbeladung Ebenen bis vorbereitet auf 14% (wt%), Wirkstoffbeladung effici-Folien&gt; 60% (w / w) und anhaltende Freisetzung des Arzneimittels über 4 Tage unter physiologisch relevanten Bedingungen (sauren und neutralen pH-Wert, Vorhandensein von Albumin). Die hohe Wirkstoffbeladung Niveau und mit verzögerter Freisetzung wird zur Stabilisierung der π-π-Wechselwirkungen zwischen DOX und dem Kern bildenden Block der Mizellen zurückgeführt.

<img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54422/54422fig3.jpg" /> Abbildung 3. Abbildung der anionische Polymerisation von Phenylglycidylether auf mPEG Makroinitiator MPEG- b zu produzieren - (PheGE) 15 zur Herstellung von Blockcopolymermizellen für die Beladung von Doxorubicin Das Schema zeigt die Deprotonierung der Hydroxylgruppe von mPEG mit Naphthalin <stron...

Die Schlüsselschritte der lebenden anionischen Polymerisation von Phenylglycidylether (PheGE) auf Methoxypolyethylenglykol (MPEG - b -PPheGE) beschrieben. Die resultierenden Blockcopolymermizellen (BCMs) wurden unter physiologisch relevanten Bedingungen wurde mit Doxorubicin 14% (wt%) und eine verzögerte Freisetzung des Arzneimittels über 4 Tage geladen erhalten.

Die anionische Polymerisation eines amphiphilen Copolymer zur Herstellung von Blockcopolymermicellen Stabilisiert durch π-π-Stapelwechselwirkungen

In this study, an amphiphilic copolymer that includes a core-forming block with phenyl groups was synthesized by living anionic polymerization of phenyl ...

Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit besteht darin, die entscheidenden Schritte für die Synthese von Blockcopolymermaterialien mittels ringöffnender anionischer Polymerisation aufzuzeigen und den notwendigen Ablauf von Untersuchungen zur Formulierung von Blockcopolymer-Micellen mit einem hydrophoben Wirkstoff zu demonstrieren. Dieses Protokoll veranschaulicht die korrekte Durchführung der erforderlichen Schritte und Verfahren für die Synthese eines Blockcopolymers durch anionische Polymerisation. Der große Vorteil der ringöffnenden anionischen Polymerisation liegt in der Synthese von Materialien in guter Ausbeute und mit geringer Dispersität.Sowie hinsichtlich der Skalierbarkeit des Verfahrens. Dies ist eine aufregende Zeit für die polymere Arzneimittelabgabe. Zahlreiche Wirkstoffe, die auf Formulierungen und Blockcopolymer-Micellen basieren, befinden sich derzeit in fortgeschrittenen präklinischen oder klinischen Entwicklungsstadien.Bereiten Sie die Reagenzien und Materialien für den Transfer gemäß der schriftlichen Anleitung vor. Wiegen Sie Methoxypolyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 5.000 ab. Geben Sie das mPEG in einen getrockneten Kolben, der einen Rührstab enthält, und verschließen Sie den Spülanschluss oben mit einem Septum.Verbinden Sie den Kolben mit dem Verteiler und spülen Sie den Kolben zwei bis drei Minuten mit Argon. Stellen Sie das Ventil auf die Vakuumposition, um den Kolben abzuspülen. Drehen Sie den Kolben manuell und trocknen Sie das Reaktionsgefäß gleichmäßig mit einem Heißluftgebläse oder einer Heißluftpistole, bis das mPEG schmilzt.Nach einer Minute wird das Vakuum unterbrochen, indem das Ventil am Verteiler mit mehreren schnellen Drehbewegungen in die Argon-Position gedreht wird, um das Kolben abzukühlen. Halten Sie das polymere Makroinitiator etwa zwei Stunden lang unter Vakuum und anschließend unter Argon, bevor die Reaktion beginnt. Danach montieren Sie zwei Hochvakuum-Destillationsapparaturen, die zuvor im Ofen unter der Abzugshaube getrocknet wurden.Ein Gerät dient zur Destillation von DMSO und ein weiteres zur Destillation des Monomers Phenylglycerolethers. Verbinden Sie die separaten Kolben mit den beiden Apparaturen und stellen Sie jede auf ein halbkugelförmiges Heizmantel oder in ein Ölbad. Schließen Sie kaltes Wasser an die Oberseite jeder Apparatur und an das Verteilerrohr an.Stellen Sie sicher, dass jedes Gerät sicher befestigt und gut abgedichtet ist. Schalten Sie das Vakuum über das Ventil ein. Stellen Sie die Heizung über einen Temperaturregler ein und beginnen Sie, die Lösungen umzurühren.Nach zweistündiger Umlaufdestillation von DMSO schließen Sie das Hochvakuumsventil, um etwa 20 Milliliter der Lösung zu sammeln. Danach geben Sie die Fraktion in den Kolben ab und wiederholen den Vorgang ein weiteres Mal, um die Reinheit der später gesammelten gewünschten Fraktion sicherzustellen. Erhitzen Sie den Kolben, der das mPEG enthält, unter Vakuum mit der Heißluftpistole, bis das Polymer schmilzt, und spülen Sie anschließend erneut mit Argon.Nach zwei Stunden schließen Sie das Hochvakuumsventil und sammeln Sie das Lösungsmittelvolumen. Stoppen Sie das Erwärmen und lösen Sie das Vakuum am Verteiler. Leiten Sie Argon in die Kammer ein, wie zuvor beschrieben.Unter positivem Druck von Argon verbinden Sie ein Ende der Kanüle mit einem Messzylinder oder direkt mit dem Kolben, der das mPEG enthält, ebenfalls unter Argon, und tauchen Sie das andere Ende vorsichtig in die frisch destillierte Fraktion ein. Schließen Sie einen zusätzlichen Bubbelierer an den Kolben an, schalten Sie den Argon-Zufluss ab und verwenden Sie ausschließlich den Argon-Druck aus der Destillationsapparatur. Um Unfälle durch Argon-Druck zu vermeiden, öffnen Sie den Glasstopfen für ein bis zwei Sekunden und schließen Sie ihn erneut, um den DMSO-Fluss fortzusetzen, bis die vollständige Übertragung abgeschlossen ist.Anschließend verbinden Sie unter Argon eine Seite der Kanüle aus dem getrockneten Messzylinder, der durch ein Septum verschlossen ist, mit einer Stammlösung aus 0,3-molarer Naphthalinkaliumlösung. Fügen Sie dann einen zusätzlichen Bubbelierer an den Messzylinder an, schließen Sie den Argonstrom zum Zylinder ab und übertragen unter positivem Argon-Druck fünf Milliliter der 0,3-molaren Naphthalinkaliumlösung mittels Kanülierung aus der Stammlösung in den Messzylinder. Führen Sie eine weitere Nadel aus dem Verteiler in den Zylinder ein und entfernen Sie den zusätzlichen Bubbelierer.Entfernen Sie vorsichtig die Kanüle, die mit der Stammlösung verbunden ist, führen Sie sie rasch in den Reaktionskolben ein und schließen Sie einen zusätzlichen Bubbelierer an. Fügen Sie anschließend, wie zuvor beschrieben, die Base tropfenweise hinzu, bis die Lösung dunkel wird. Nach dem langsamen Verschwinden der Farbe geben Sie eine weitere Portion hinzu, bis die dunkle Farbe erneut erscheint, und wiederholen Sie diesen Schritt, bis die vollständige Übertragung erfolgt ist.Wie zuvor beschrieben, das gewünschte Volumen des Monomers zur Reaktion geben, um einen Polymerisationsgrad des Polyphenolglykolethers von etwa 18 bis 20 Einheiten zu erreichen. Die Reaktion 48 Stunden bei 80 Grad Celsius unter Argonatmosphäre mit ständigem Rühren stehen lassen, um eine vollständige Polymerisation sicherzustellen. Die Reaktion durch Zugabe von Tropfen einnormaler Salzsäure und Methanol abbrechen, wie durch Verschwinden der Farbe beobachtet.Extrahieren Sie das Naphthalin aus der DMSO-Lösung mit Hexan. Entfernen Sie etwa 70 Milliliter des DMSO durch Destillation unter Vakuum. Kühlen Sie die Suspension ab und geben Sie 15 Milliliter THF hinzu.Entfernen Sie das Salz aus der Suspension durch Zentrifugation bei 5.000 × g für zehn Minuten. Überführen Sie das Überstand und geben Sie diesen tropfenweise zu 500 Milliliter kaltem Diethylether. Sammeln Sie das Präzipitat durch Filtration oder Zentrifugation.Nachdem die Fällung zweimal wiederholt wurde, trocknen Sie das Präzipitat über Nacht bei Raumtemperatur im Abzug und anschließend 24 bis 48 Stunden im Vakuum bei 30 Grad Celsius, wobei eine Ausbeute von 85 % erzielt wird. Das Copolymer ist nun zur Charakterisierung bereit, wie im Textprotokoll beschrieben. Lösen Sie 12 Milligramm Doxorubicin in einem Milliliter Acetonitril. Geben Sie 10 Mikroliter Triethylamin hinzu und lassen Sie die Lösung zwei Stunden im Dunkeln rühren.Lösen Sie 45 Milligramm Copolymer in einem Milliliter THF auf und rühren Sie für den gleichen Zeitraum. Geben Sie die Copolymerlösung zur Doxorubicinlösung und spülen Sie das Röhrchen mit restlichem Copolymer mit einem zusätzlichen Volumen THF aus. Fügen Sie anschließend das Copolymer-Wirkstoff-Gemisch tropfenweise einem 20-Milliliter-Röhrchen mit 15 Milliliter 0,9%iger Kochsalzlösung unter Rühren hinzu.Überführen Sie die Lösung in einen Dialysebeutel und dialysieren Sie gegen 500 Milliliter 0,9 %iger Kochsalzlösung. Überführen Sie das Dialysat in ein 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie es 15 Minuten lang mit 5.000 × g. Anschließend überführen Sie den Überstand in ein Ultrafiltrationssystem, das eine Dialysemembran enthält.Stellen Sie den Rühradapter in das Ultrafiltrationssystem, schließen Sie den Deckel und öffnen Sie es zur Stickstoffatmosphäre. Konzentrieren Sie die Lösung der Blockcopolymer-Micellen auf ein Volumen von vier Millilitern und geben Sie sechs Milliliter frische Kochsalzlösung hinzu. Anschließend konzentrieren Sie die Lösung der Blockcopolymer-Micellen erneut auf 4 Milliliter, spülen die Kammer mit 0,5 Millilitern Kochsalzlösung aus und geben diese zur Lösung hinzu.Bewahren Sie die resultierende Lösung vor der weiteren Verwendung in braunen Fläschchen bei Raumtemperatur und im Dunkeln auf. Die anionische Ringöffnungspolymerisation von Phenylglycerolether am mPEG-Makroinitiator wurde zur Herstellung des amphiphilen Diblockcopolymeren durch tiefe Protonierung der Hydroxylgruppe von mPEG verwendet. Unter Verwendung von Naphthalinkalium als radikalischem Anion, gefolgt von der Polymerisation des Phenylglycerolether-Monomeren.Die Charakterisierung des Blockcopolymers mittels Gelpermeationschromatographie und Protonen-NMR-Spektroskopie bestätigte eine enge molare Massenverteilung mit einem Polymerisationsgrad von 15 Einheiten für Phenylglycerolether. In wässrigem Medium aggregieren die amphiphilen Blockcopolymere zu Mizellen, die aus einem hydrophoben Kern bestehen, der von einer hydrophilen Hülle umgeben ist. Die Transmissionselektronenmikroskopie bestätigte eine sphärische Morphologie, und die dynamische Lichtstreuung zeigte einen hydrodynamischen Durchmesser von 25 nm.Doxorubicin wurde erfolgreich in den Blockcopolymer-Micellen eingeschlossen. Im Vergleich zum freien protonierten Wirkstoff in Lösung bestätigte die Selbstabschirmung des Doxorubicins, die mittels Fluoreszenzspektroskopie beobachtet wurde, die Einlagerung des Wirkstoffs in die polymeren Micellen, mit einer Wirkstoffladekapazität von bis zu 14 %. Das Freisetzungsprofil von Doxorubicin aus den Blockcopolymer-Micellen zeigte eine gute Stabilität dieser Formulierung bei neutralem pH-Wert und eine kontinuierliche Freisetzung des Wirkstoffs über vier Tage unter physiologisch relevanten Bedingungen.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie Auszubildenden in den pharmazeutischen Wissenschaften helfen, die Synthese von Diblock-Copolymeren für Anwendungen in der Arzneimittelabgabe vorzubereiten. Dieses hier beschriebene Verfahren kann zur Synthese einer breiten Palette von Copolymeren mit PEG als Initiator angewendet werden. Besonderes Augenmerk wurde darauf gelegt, gute Laborpraktiken sicherzustellen, die anhydrische Bedingungen gewährleisten und zu Materialien hoher Qualität führen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man unter wasserfreien Bedingungen arbeitet, und sollten in der Lage sein, diese Schritte für die Synthese von PEG-Polyestern oder PEG-Polyestermaterialien anzuwenden. Bei der Durchführung der beschriebenen Forschungsarbeiten ist es unerlässlich, daran zu denken, dass Sie unter kontrollierten Bedingungen mit potenziell gefährlichen organischen Lösungsmitteln und anderen Substanzen arbeiten. Darüber hinaus sind alle Arzneimittel toxisch und müssen unter Anwendung der erforderlichen Vorsichtsmaßnahmen gehandhabt werden.Zum Beispiel das Tragen von Handschuhen, einem Laborkittel und geschlossenen Schuhen sowie das Tragen einer Maske beim Wiegen der Wirkstoffe.

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Chemie

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Die anionische Polymerisation eines amphiphilen Copolymer zur Herstellung von Blockcopolymermicellen Stabilisiert durch π-π-Stapelwechselwirkungen (Video) | JoVE Journal

Die anionische Polymerisation eines amphiphilen Copolymer zur Herstellung von Blockcopolymermicellen Stabilisiert durch π-π-Stapelwechselwirkungen

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