Name: La Préparation de la moelle épinière Oblique tranches pour ventral Racine Stimulation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Apprenez à préparer des coupes obliques de moelle épinière chez la souris pour stimuler les racines ventrales. Cette technique permet d'identifier les motoneurones et d'étudier les cellules ventrales innervées par leurs collatérales axonales.

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Les auteurs remercient Marin Manuel et Olivia Goldman-Szwajkajzer pour leur aide dans la prise des photos. Les auteurs remercient également Arjun Masukar et Tobias Bock pour la relecture du manuscrit. supports financiers ont été fournis par l&#39;Agence Nationale pour la Recherche (HYPER-MND, ANR-2010-BLAN-1429-01), le NIH-NINDS (R01NS077863), la Fondation Thierry Latran (OHEX Project), l&#39;association française de myopathie ( numéro de subvention 16026) et Target ALS sont appréciés. Felix Leroy était le destinataire d&#39;un &quot;Contrat doctoral&quot; de l&#39;Ecole Normale Supérieure, Cachan.

Les expériences ont été réalisées conformément aux directives européennes (86/609 / CEE et 2010-63-UE) et de la législation française, et ont été approuvés par le comité d&#39;éthique de l&#39;Université Paris Descartes. 1. Préparation de la moelle épinière Slice <ol><li> Préparer les solutions quotidiennes ou suivantes un jour à l&#39;avance. Si elles sont conservées pendant une nuit, bulle avec 95% O 2 et 5% de CO 2 et de garder au réfrigérateur dans des flacons fermés hermétiquement. <ol><li> Préparer faible Na + liquide artificiel céphalorachidien (ACSF): 3 mM de KCl, 1 mM de NaH 2 PO 4, 230 mM de saccharose, 26 mM NaHCO3, 0,8 mM de CaCl2, 8 mM de MgCl2, 25 mM de glucose, l&#39; acide ascorbique 0,4 mM, 1 mM de Na-kynurénate, 2 mM de pyruvate. Bulle avec 95% O 2 et 5% de CO 2 (pH 7,4). Depuis Na-kynurénate est souvent difficile à dissoudre, assurez-vous d&#39;acheter celui indiqué dans le tableau des matériaux. </li><li> Préparer solu K-gluconatetion: 130 mM de K-gluconate, 15 mM de KCl, 0,05 mM d&#39; EGTA, 20 mM de HEPES, 25 mM de glucose, 1 mM de Na-kynurénate, 2 mM de Na-pyruvate, ajusté à pH 7,4 avec du KOH. </li><li> Préparer ACSF: 130 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM de NaH 2 PO 4 26 mM NaHCO3, 25 mM de glucose, 0,4 mM d&#39; acide ascorbique, 2 mM de pyruvate. Bulle avec 95% O 2 et 5% de CO 2 (pH 7,4). </li><li> Avant le début de la dissection, dissoudre 2% d&#39;agar dans 80 ml de la solution K-gluconate, et garder au chaud à 60 ° C. </li></ol></li><li> intracardiaque perfusion <ol><li> Effectuer cette préparation sur des souris femelles et mâles, âgés de P2 à P11. </li><li> Anesthésier la souris avec une injection intraperitoneale de 0,1 ml de 25 mM de pentobarbital sodique (50 mg / kg). </li><li> L&#39;utilisation d&#39;aiguilles ou de bande, immobiliser la souris sur le dos sur une grande boîte de Pétri remplie de silicium. Utilisez un Microscope disséquante pour le reste de la dissection. </li><li> Tenir la pointe du sternum, soulever la poitrine et couper la membrane à l&#39;aide de ciseaux fins. Ouvrez ensuite la poitrine des deux côtés en coupant à travers les côtes pour exposer le cœur. </li><li> Couper l&#39;oreillette droite avant de percer le ventricule gauche avec une aiguille de 27G. </li><li> Perfuser avec de la glace froide faible ACSF Na +. Au bout de 30 secondes, le plus bas de Na + ACSF doit être considéré circulant hors de l&#39;atrium. De faibles quantités de sodium empêchent les cellules à partir de dopage et à réduire la mort cellulaire lors de la dissection. </li><li> Maintenez l&#39;aiguille dans le cœur sous le microscope de dissection jusqu&#39;à ce que le foie devient jaune lorsque le sang est drainé. </li></ol></li><li> Spinal dissection du cordon <ol><li> Décapitez l&#39;animal et le mettre sur le ventre. </li><li> Retirez rapidement la peau du dos (figure 1A1). Faites deux coupes à travers les épaules et en descendant la cage thoracique (figure 1A2). Ensuite, couper le cordon en loe que possible dans la partie caudale afin d&#39;isoler la colonne vertébrale avec le début des nervures de la partie inférieure de l&#39;animal. Retournez l&#39;animal à nouveau et retirer les viscères encore attachés aux côtes. </li><li> Transférer la colonne vertébrale à un autre, plus petite boîte de Pétri silicium-rempli et utiliser 4 broches d&#39; insectes pour le maintenir dorsale vers le haut (figure 1A). </li><li> Perfuser en continu l&#39;animal avec l&#39; ACSF carbogène-barboter (à environ 4 ° C) tout en effectuant une laminectomie de la face dorsale, et l&#39; exposition de la moelle épinière de l&#39;extrémité rostrale (figure 1B). Pour ce faire, insérez la pointe des ciseaux fins entre l&#39;os et la moelle épinière et couper l&#39;os peu à peu de la fin rostrale, en veillant à rester à l&#39;écart de la matière blanche. Alternate de chaque côté tout en utilisant des pinces pour tenir à l&#39; écart de la bande de l&#39; os déjà coupé (Figure 1B1). </li><li> En utilisant les plus petits ciseaux et des pinces à ressort disponibles, soulevez la dure et coupesur les deux côtés tout en maintenant la partie non serrée de la dure-mère, afin d&#39;éviter d&#39;endommager la moelle épinière avec des ciseaux. Couper le long de l&#39;axe rostro-caudale. NOTE: La dure est une membrane continue semi transparent; à cet âge la pie - mère est trop fragile et se désagréger lors de la dissection et le tranchage (Figure 1B2). </li><li> Une fois que la dure est l&#39;utilisation enlevé un verre contondant ou embout en plastique pour pousser doucement le cordon sur le côté gauche de la gorge formée par la colonne vertébrale demi-coupe, et couper les racines ventrales et dorsales sur le côté droit, en partant du côté rostral , le plus éloigné où ils entrent dans le cordon (quelques mm au moins, Figure 1B2). </li><li> Répéter l&#39;opération sur le côté gauche, allant toujours de rostrale à caudale. Si gaucher, démarrer à partir du côté gauche, puis déplacer vers le côté droit. </li></ol></li><li> Incorporation dans la gélose <ol><li> Glissez le cordon de la colonne vertébrale. Utilisez une épingle d&#39;insectes plus petits à cernerle cordon avec la dorsale de surface et enlever délicatement toute pièce de membrane encore attaché à elle (Figure 1C1). </li><li> Une fois nettoyé, coupez les deux extrémités (figure 1C2). Insérez une épingle d&#39; insectes cintré dans la partie antérieure du cordon pour manipuler le cordon et notez son orientation (flèche dans la figure 1C2). Puis transférer la moelle épinière à une solution K-gluconate glacée. NOTE: Cette solution imite la composition intracellulaire du CSF et empêcher les cellules de mourir de choc osmotique une fois que les motoneurones seront coupés 26. </li><li> Une fois que la moelle épinière est dans la solution intra-cellulaire, prenez le bécher avec l&#39;agar du bain sec et refroidir sur un mélange de glace et d&#39;eau. </li><li> Gardez en remuant tout en mesurant la température. Lorsque la température atteint 38 ° C plonger la moelle épinière, en le tenant par la broche d&#39;insectes et le placer côté rostral vers le bas. Assurez-vous que la moelle épinière est comme straight que possible, loin des murs, partie caudale légèrement vers le haut (Figure 1D1). </li><li> Laisser le bécher dans le mélange de glace et de l&#39;eau pour permettre à l&#39;agar se solidifier le plus rapidement possible. Assurez - vous qu&#39;il reste en place et que le cordon est aussi droite que possible (Figure 1D1). </li></ol></li><li> Slicing <ol><li> Après solidification, découper le bloc d&#39; agar contenant de la moelle épinière , d&#39;une manière telle que la base du bloc est à un angle de 35 ° avec la partie lombaire du cordon (flèche sur la figure 1D2). La surface dorsale doit être orientée de la base (Figure 1D2). NOTE: Ceci est une étape critique dans la procédure, pour le maintien de la continuité des pools de motoneurones aux racines ventrales à partir de laquelle ils sortent. </li><li> Coller le bloc dans la chambre du vibratome en utilisant de la colle cyanoacrylate. Immergez en solution K-gluconate et ajouter la solution K-gluconate congelée en bouillie pour maintenirle bain refroidi (en dessous de 2 ° C). </li><li> Couper 350 - 400 um d&#39;épaisseur des tranches de la région lombaire (identifiable par sa courbure et plus grand diamètre). Dans sa bonne orientation (voir 1.4.1.), Utilisez la lame pour couper de la dorsale à la surface ventrale et faire des tranches en continu plus rostrale. En règle générale, il y a 4-5 tranches convenables avec des racines ventrales étendant de 2 mm ou plus. Utiliser les paramètres suivants: angle de 10 °, 70 Hz, la fréquence de vibration et de 10 mm / min Vitesse de découpe. </li></ol></li><li> Incubation <ol><li> Transférer les tranches à ACSF à 34 ° C. Au bout d&#39;environ 30 minutes, refroidir les tranches jusqu&#39;à la température ambiante et commencer la session d&#39;enregistrement. </li></ol></li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig1.jpg" /> Figure 1. Dissection A1:. L&#39; élimination de la peau du dos pour exposer la colonne dorsale A2:Coupe des épaules et des côtes pour libérer la dorsale colonne B1:. Colonne vertébrale épinglé sur la boîte de Pétri silicium-rempli (côté dorsal haut, côté caudal gauche) B2:. Même avec la moelle épinière exposée et disséqués C1:. Moelle épinière isolée . (côté gauche rostrale) C2: moelle épinière prêt à être embarqué (face ventrale, latérale rostrale gauche). Notez la broche d&#39;insecte plus petit sur le côté rostrale D1:.. La moelle épinière dans le bécher de gélose (côté rostrale dow, face ventrale tournée vers le bas) D2: Couper le bloc de gélose avec la moelle épinière incorporée. Notez l&#39;angle de 35 ° les formes de la moelle épinière à la base du bloc et le renflement lombaire (flèche). Barres d&#39;échelle 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> 2. Placer le Slice dans la Chambre NOTE: Ventral racines sont de taille variable. <ol><li> Préparer une boîte de diverses pipettes avec des diamètres de pointe allant de 40 à 170 pm à l&#39;avance. Pour préparer les pipettes d&#39;aspiration, préparer de nombreux pipettes avec un long cône. L&#39;utilisation d&#39;un couteau de diamant, faire une coupe à différentes positions. Puis, sous un microscope à dissection, briser en frappant la pointe avec des pincettes. </li><li> Retirer la chambre du microscope d&#39;enregistrement et de le placer sous un microscope à dissection. </li><li> Sélectionner une tranche contenant une racine ventrale d&#39;une longueur suffisante de 2 mm (ou plus) pour être monté sur une électrode de stimulation d&#39;aspiration. Sélectionnez la bonne orientation de la tranche avec les racines ventrales vers le haut (figure 2A) et couper délicatement l&#39;agar autour des racines ventrales tout en laissant le reste de l&#39;agar autour de la tranche (figure 2B). NOTE: Parce que l&#39;agar-agar est plus ferme que la tranche, cela va permettre aux fils de l&#39;ancre de la tranche de se reposer sur l&#39;agar plutôt que sur la tranche et donc unnchor ne sera pas endommager le tissu. Assurez - vous que les fils de l&#39;ancre de la tranche sont au- dessus de la piscine du motoneurone (en rouge sur la figure 2C). </li><li> Monter la chambre arrière sur le microscope et perfuser en continu la chambre d&#39;enregistrement avec ACSF à un taux de 1 - 2 ml / min, à la température ambiante. En utilisant une pipette en verre rempli d&#39;ACSF et relié à une seringue, une aspiration de la racine ventrale (flèche sur la figure 2C). Afin d&#39;obtenir une bonne stimulation de la racine ventrale, la pointe de la pipette doit être serré autour de la racine ventrale. Un pôle doit être de l&#39;électrode de stimulation et l&#39;autre dans le bain (ou relié à la plaque d&#39;électrode de référence de serrage). </li><li> Réaliser l&#39; enregistrement patch-clamp du type cellulaire souhaité et enregistrer l&#39;effet de la stimulation de la racine ventrale comme décrit previsouly 10. <ol><li> Ici, utiliser un amplificateur pour l&#39;acquisition de données. Filtrez les enregistrements de cellules entières à 3 kHz. Numérisez à 10 kHz. Compenser résistance pont currele mode NT-pince. </li></ol></li></ol><img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig2.jpg" /> Figure 2. ventral Racine Préparation R: Lumbar tranche de la moelle épinière noyée dans de la gélose à la racine ventrale vers le haut B. Lumbar tranche de la moelle épinière avec les racines ventrales libérés de l&#39;agar - agar . C: Lumbar tranche de la moelle épinière avec une électrode de stimulation ajusté serré autour des racines ventrales (flèche) . Notez l&#39;emplacement des cellules de Renshaw exprimant la fluorescence rouge dans le 28 chrna2-Cre souris croisé avec le journaliste de la souris R26 Tom 17. Les barres d&#39;échelle 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

<ol><li>Brooks, C. M., Downman, C. B., Eccles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((After-potentials+and+excitability+of+spinal+motoneurones+following+antidromic+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">After-potentials and excitability of spinal motoneurones following antidromic activation.</a> J Neurophysiol. 13 (1), 9-38 (1950).</li>
<li>Bories, C., Amendola, J., Lamotte d'Incamps, B., Durand, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+electrophysiological+abnormalities+in+lumbar+motoneurons+in+a+transgenic+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Early electrophysiological abnormalities in lumbar motoneurons in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Eur J Neurosci. 25 (2), 451-459 (2007).</li>
<li>Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+currents+in+visually+identified+motoneurones+of+neonatal+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Membrane currents in visually identified motoneurones of neonatal rat spinal cord.</a> J Physiol. 423, 27-46 (1990).</li>
<li>Hori, N., Tan, Y., Strominger, N. L., Carpenter, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+activity+of+rat+spinal+cord+motoneurons+in+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Intracellular activity of rat spinal cord motoneurons in slices.</a> J Neurosci Methods. 112 (2), 185-191 (2001).</li>
<li>Arai, Y., Mentis, G. Z., Wu, J. Y., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventrolateral+origin+of+each+cycle+of+rhythmic+activity+generated+by+the+spinal+cord+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ventrolateral origin of each cycle of rhythmic activity generated by the spinal cord of the chick embryo.</a> PLoS One. 2 (5), e417(2007).</li>
<li>Cullheim, S., Lipsenthal, L., Burke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+monosynaptic+contacts+between+type-identified+alpha-motoneurons+in+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Direct monosynaptic contacts between type-identified alpha-motoneurons in the cat.</a> Brain Res. 308 (1), 196-199 (1984).</li>
<li>Cullheim, S., Kellerth, J. O., Conradi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+direct+synaptic+interconnections+between+cat+spinal+alpha-motoneurons+via+the+recurrent+axon+collaterals%3A+a+morphological+study+using+intracellular+injection+of+horseradish+peroxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Evidence for direct synaptic interconnections between cat spinal alpha-motoneurons via the recurrent axon collaterals: a morphological study using intracellular injection of horseradish peroxidase.</a> Brain Res. 132 (1), 1-10 (1977).</li>
<li>Gogan, P., Gueritaud, J. P., Horcholle-Bossavit, G., Tyc-Dumont, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+excitatory+interactions+between+spinal+motoneurones+of+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Direct excitatory interactions between spinal motoneurones of the cat.</a> J Physiol. 272 (3), 755-767 (1977).</li>
<li>Ichinose, T., Miyata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+excitation+of+motoneurons+in+the+isolated+spinal+cord+of+newborn+rats+detected+by+whole-cell+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Recurrent excitation of motoneurons in the isolated spinal cord of newborn rats detected by whole-cell recording.</a> Neurosci Res. 31 (3), 179-187 (1998).</li>
<li>Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+excitatory+postsynaptic+ionotropic+receptors+coactivated+at+the+motoneuron-Renshaw+cell+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Four excitatory postsynaptic ionotropic receptors coactivated at the motoneuron-Renshaw cell synapse.</a> J Neurosci. 28 (52), 14121-14131 (2008).</li>
<li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+effects+of+centripetal+impulses+in+axons+of+spinal+ventral+roots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Central effects of centripetal impulses in axons of spinal ventral roots.</a> J Neurophysiol. 9, 191-204 (1946).</li>
<li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+nerve+impulses+in+the+gray+matter+as+a+mechanism+in+central+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Fed+Proc%22%5BJournal%5D)">Interaction of nerve impulses in the gray matter as a mechanism in central inhibition.</a> Fed Proc. 5 (1 Pt 2), 86(1946).</li>
<li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+interaction+of+nerve+impulses+in+the+gray+matter+and+on+the+nature+of+central+inhibition%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Observations on interaction of nerve impulses in the gray matter and on the nature of central inhibition).</a> Am J Physiol. 146, 443-448 (1946).</li>
<li>Pambo-Pambo, A., Durand, J., Gueritaud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+excitability+changes+in+lumbar+motoneurons+of+transgenic+SOD1G85R+and+SOD1G%2893A-Low%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Early excitability changes in lumbar motoneurons of transgenic SOD1G85R and SOD1G(93A-Low) mice.</a> J Neurophysiol. 102 (6), 3627-3642 (2009).</li>
<li>Quinlan, K. A., Schuster, J. E., Fu, R., Siddique, T., Heckman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+postnatal+maturation+of+electrical+properties+in+spinal+motoneurons+in+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Altered postnatal maturation of electrical properties in spinal motoneurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Physiol. 589 (Pt 9), 2245-2260 (2011).</li>
<li>Martin, E., Cazenave, W., Cattaert, D., Branchereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+alteration+of+motoneuronal+morphology+induces+hyperexcitability+in+the+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Embryonic alteration of motoneuronal morphology induces hyperexcitability in the mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurobiol Dis. 54, 116-126 (2013).</li>
<li>Hadzipasic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+degeneration+of+a+physiological+subtype+of+spinal+motor+neuron+in+mice+with+SOD1-linked+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Selective degeneration of a physiological subtype of spinal motor neuron in mice with SOD1-linked ALS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16883-16888 (2014).</li>
<li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li>
<li>Tallini, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC+transgenic+mice+express+enhanced+green+fluorescent+protein+in+central+and+peripheral+cholinergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons.</a> Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).</li>
<li>Manuel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+kinetics%2C+high-frequency+oscillations%2C+and+subprimary+firing+range+in+adult+mouse+spinal+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons.</a> J Neurosci. 29 (36), 11246-11256 (2009).</li>
<li>Obeidat, A. Z., Nardelli, P., Powers, R. K., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+motoneuron+firing+by+recurrent+inhibition+in+the+adult+rat+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of motoneuron firing by recurrent inhibition in the adult rat in vivo.</a> J Neurophysiol. 112 (9), 2302-2315 (2014).</li>
<li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+intrinsic+hyperexcitability+does+not+contribute+to+motoneuron+degeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Elife. 3, (2014).</li>
<li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+currents+dynamically+set+the+recruitment+and+firing+properties+of+F-type+motoneurons+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Potassium currents dynamically set the recruitment and firing properties of F-type motoneurons in neonatal mice.</a> J Neurophysiol. 114 (3), 1963-1973 (2015).</li>
<li>Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+composition+and+kinetics+of+the+Renshaw+cell+heteromeric+nicotinic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Subunit composition and kinetics of the Renshaw cell heteromeric nicotinic receptors.</a> Biochem Pharmacol. 86 (8), 1114-1121 (2013).</li>
<li>Lamotte d'Incamps, B., Krejci, E., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+shaping+the+slow+nicotinic+synaptic+current+at+the+motoneuron-renshaw+cell+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms shaping the slow nicotinic synaptic current at the motoneuron-renshaw cell synapse.</a> J Neurosci. 32 (24), 8413-8423 (2012).</li>
<li>Dugue, G. P., Dumoulin, A., Triller, A., Dieudonne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-dependent+use+of+co-released+inhibitory+transmitters+at+central+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Target-dependent use of co-released inhibitory transmitters at central synapses.</a> J Neurosci. 25 (28), 6490-6498 (2005).</li>
<li>Mentis, G. Z., Siembab, V. C., Zerda, R., O'Donovan, M. J., Alvarez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+afferent+synapses+on+developing+and+adult+Renshaw+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Primary afferent synapses on developing and adult Renshaw cells.</a> J Neurosci. 26 (51), 13297-13310 (2006).</li>
<li>Perry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firing+properties+of+Renshaw+cells+defined+by+Chrna2+are+modulated+by+hyperpolarizing+and+small+conductance+ion+currents+Ih+and+ISK%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Firing properties of Renshaw cells defined by Chrna2 are modulated by hyperpolarizing and small conductance ion currents Ih and ISK.</a> Eur J Neurosci. 41 (7), 889-900 (2015).</li>
<li>Thurbon, D., Luscher, H. R., Hofstetter, T., Redman, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+electrical+properties+of+ventral+horn+neurons+in+rat+spinal+cord+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Passive electrical properties of ventral horn neurons in rat spinal cord slices.</a> J Neurophysiol. 79 (5), 2485-2502 (1998).</li>
<li>Zengel, J. E., Reid, S. A., Sypert, G. W., Munson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+electrical+properties+and+prediction+of+motor-unit+type+of+medial+gastrocnemius+motoneurons+in+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Membrane electrical properties and prediction of motor-unit type of medial gastrocnemius motoneurons in the cat.</a> J Neurophysiol. 53 (5), 1323-1344 (1985).</li>
<li>Cooper, S., Sherington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gower%27s+tract+and+spinal+border+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Gower's tract and spinal border cells.</a> Brain. 63, 123-124 (1940).</li>
<li>Morin, F., Schwartz, H. G., O'Leary, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+study+of+the+spinothalamic+and+related+tracts%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Psychiatr+Neurol+Scand%22%5BJournal%5D)">Experimental study of the spinothalamic and related tracts.</a> Acta Psychiatr Neurol Scand. 26 (3-4), 371-396 (1951).</li>
<li>Sengul, G., Fu, Y., Yu, Y., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+projections+to+the+cerebellum+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Spinal cord projections to the cerebellum in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 220 (5), 2997-3009 (2015).</li>
<li>Russier, M., Carlier, E., Ankri, N., Fronzaroli, L., Debanne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A-%2C+T-%2C+and+H-type+currents+shape+intrinsic+firing+of+developing+rat+abducens+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">A-, T-, and H-type currents shape intrinsic firing of developing rat abducens motoneurons.</a> J Physiol. 549 (Pt 1), 21-36 (2003).</li>
<li>Dourado, M., Sargent, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+nicotinic+receptors+underlying+Renshaw+cell+excitation+by+alpha-motor+neurons+in+neonatal+rat+spinal+cord%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Properties of nicotinic receptors underlying Renshaw cell excitation by alpha-motor neurons in neonatal rat spinal cord).</a> J Neurophysiol. 87 (6), 3117-3125 (2002).</li>
<li>Mitra, P., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+spinal+cord+slice+preparation+for+recording+from+lumbar+motoneurons+of+the+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse.</a> J Neurophysiol. 107 (2), 728-741 (2012).</li>
<li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> J Neurosci. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li>
<li>Olney, J. W., Price, M. T., Samson, L., Labruyere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+specific+ions+in+glutamate+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">The role of specific ions in glutamate neurotoxicity.</a> Neurosci Lett. 65 (1), 65-71 (1986).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

tranchage Oblique de la moelle épinière est importante car elle permet une stimulation unilatérale des pools de motoneurones et les cellules de Renshaw à un segment vertébral unique d&#39;une manière fiable, complète et spécifique. En outre, il permet une identification rapide, élégant et non-ambiguë des motoneurones enregistrées. Ensuite, nous allons mettre en évidence les avantages de cette technique par rapport à d&#39;autres méthodes de préparation de tranche, puis nous allons insister sur les pièges les plus couran...

Historiquement, les enregistrements de motoneurones utilisant sharp-électrode ont été réalisées in vivo sur les grands animaux tels que les chats ou rats 1 ou sur un ensemble de la moelle épinière isolée chez la souris 2. L&#39;émergence de la technique d&#39;enregistrement patch-clamp pendant les années 1980, a appelé à un accès direct à la motoneurone somas que l&#39;étanchéité nécessaire pour être réalisé sous guidage visuel. Ainsi, la moelle épinière préparation de tranche a été facilement atteint depuis le début des années 1990 3. Cependant, au début de la préparation tranche souvent ne permettait pas la stimulation des racines ventrales. Au meilleur de notre connaissance, seules deux études ont rapporté une stimulation réussie des racines ventrales en tranches transversales, et aucun n&#39;a été obtenu à partir de souris 4,5. Dans cet article, nous présentons une technique pour obtenir des tranches viables de la moelle épinière de souris néonatale (P2 - P11) dans lequel le pool de motoneurones conserve ses racines au départ ventrales axones. conduitla stimulation de la racine ral déclenche potentiel d&#39;action antidromique de nouveau dans les somas de la piscine du motoneurone sortant de la même racine ventrale. Il excite aussi les cibles collatérales du motoneurone, d&#39; autres motoneurones 6-10 et les cellules de Renshaw 11-13. Étant donné que seuls les motoneurones envoient leurs axones vers le bas les racines ventrales, nous utilisons l&#39;enregistrement des potentiels d&#39;action antidromiques comme un moyen simple et définitive à physiologicaly identifier motoneurones 10. En plus d&#39;utiliser des critères électrophysiologiques et morphologiques potentiellement non inclusives ou trompeuses pour confirmer l&#39;identité des motoneurones, des études récentes sur les motoneurones de la moelle épinière invoquaient également fastidieuse et chronophage post hoc Colorations 16. Une telle identification est habituellement effectuée uniquement sur un échantillon des cellules enregistrées. D&#39;autres stratégies d&#39;identification reposent sur des lignées de souris dans lequel les motoneurones expriment une fluorescence endogène <sup&gt; 17-19. Cependant, en utilisant des marqueurs codés génétiquement peut être difficile à un jeune âge où l&#39;expression du marqueur est encore variable ou si l&#39;étude exige déjà en utilisant une lignée de souris transgéniques. En variante, l&#39;action antidromique enregistrements éventuels peuvent être effectués en routine sur toutes les souris à partir du début de l&#39;enregistrement de la cellule. Expérimentateurs travaillant sur intactes les préparations de la moelle épinière chez le chat, le rat et la souris, ont utilisé de manière fiable ces techniques d&#39;identification depuis les années 1950, 1,2,20,21. Dans des conditions optimales, nous avons pu obtenir des potentiels d&#39;action antidromiques de la quasi-totalité des motoneurones enregistrées. En outre, la stimulation de la racine ventrale peut être utilisé de manière fiable pour exciter les autres motoneurones 22,23 ou leurs cibles. les cellules de Renshaw 10,24,25. Nous présentons ici les applications de la stimulation de la racine ventrale sous la forme d&#39;actions antidromique enregistrements potentiels de motoneurone somas, ainsi que l&#39;excitation des cellules de Renshaw.

<table><tbody><tr><td>Na-kynurenate</td><td>ABCAM</td><td>ab120256</td> se <td>dissout mieux que les autres marques</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>saccharose&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp ;</td><td>G Biosciences</td><td>R040</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp ;</td><td>Qualité Biologique</td><td>351-033-721</td><td></td></tr><tr><td>glucose&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>acide ascorbique&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>Na-pyruvate&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>P2250</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconate&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>EGTA&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A9799</td><td></td></tr><tr><td>QX-314</td><td>Alomone</td><td>Q150</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>CsOH</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>Na-GTP</td><td>Sigma</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>acide gluconique</td><td>Sigma</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’hydroxyde de césium</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort Vannas - 2.5mm&nbsp ;</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td>à utiliser uniquement pour couper la dure-mère, peut être endommagé si vous coupez les os</td></tr><tr><td>Stimulateur</td><td>A-M Systems</td><td>Stimulateur à impulsions isolées Modèle 2100</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Campden Vibrant</td><td>Microtome 7000 - Modèle 7000smz-2</td><td></td></tr></tbody></table>

la préparation de la moelle épinière oblique tranches pour ventral racine stimulation

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

enregistrements électrophysiologiques à partir de tranches de la moelle épinière se sont révélés être une technique précieuse pour enquêter sur un large éventail de questions, de cellulaire aux propriétés du réseau. Nous montrons comment préparer des tranches obliques viables de la moelle épinière des souris jeunes (P2 - P11). Dans cette préparation, les motoneurones conservent leurs axones sortant des racines ventrales de la moelle épinière. La stimulation de ces axones suscite back-propageant des potentiels d&#39;action qui envahissent le soma des motoneurones et passionnants nantissements l&#39;motoneuronales au sein de la moelle épinière. Enregistrement des potentiels d&#39;action antidromiques est une façon immédiate, définitive et élégante pour caractériser l&#39;identité du motoneurone, qui surpasse les autres méthodes d&#39;identification. En outre, la stimulation des nantissements de motoneurones est un moyen simple et fiable pour exciter les cibles collatérales des motoneurones au sein de la moelle épinière, comme d&#39;autres motoneurones ou Renshaw cellules. Dans ce protocole, nous présentons les enregistrements antidromiques du motoneurone somas ainsi que Renshaw cellulaire excitation, résultant de la stimulation de la racine ventrale.

Confirmation de motoneurones Identité utilisant Potentiels antidromique action ciblage cellulaire Motoneurones se trouvent dans la corne ventrale (visible en rouge sur la figure 2C). Commencez par le faisceau d&#39;axones formant la racine ventrale et remonter jusqu&#39;à ce que le faisceau se disperse complètement et...

Nous montrons comment préparer des tranches obliques de la moelle épinière chez les jeunes souris. Cette préparation permet la stimulation des racines ventrales.

La Préparation de la moelle épinière Oblique tranches pour ventral Racine Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

L'objectif général de cette procédure est de préparer des tranches obliques de la moelle épinière permettant la stimulation des racines ventrales. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet l'identification des motoneurones pour la stimulation des racines ventrales et l'étude des cellules ventrales innervées par les collatérales axonales des motoneurones. Nous avons eu l'idée de cette méthode en cherchant un moyen fiable de stimuler les cellules ventrales.Les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés en raison de la complexité liée à l'exécution correcte des différentes étapes de la dissection. Commencez par perfuser un souriceau âgé de P2 à P11 avec du ACSF à faible teneur en sodium. Après avoir décapité la souris et retiré la peau du dos, effectuez deux incisions au niveau des épaules et le long de la cage thoracique.Ensuite, sectionner la moelle épinière aussi bas que possible dans la partie caudale afin d'isoler la colonne vertébrale et les côtes de la partie inférieure de l'animal. Retourner la colonne vertébrale et retirer les viscères encore attachés aux côtes. Transférer la colonne vertébrale dans une autre boîte de Pétri plus petite,

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Nous décrivons les procédures de préparation et d'enregistrement électrophysiologique de tranches de cerveau qui maintiennent l'axe dorso-ventral de l'médial cortex entorhinal (MEC). Parce que le codage neuronal de l'emplacement suit une organisation dorso-ventrale au sein de la MEC, ces procédures de faciliter les enquêtes des mécanismes cellulaires importants pour la navigation et de la mémoire.

Préparation des tranches de parasagittales d&#39;enquête sur les dorso-ventrale de l&#39;Organisation des rongeurs cortex entorhinal médian

Cette vidéo décrit l’enregistrement intracellulaire in vivo de motoneurones de rats sous stimulation transspinale à courant continu. Le protocole décrit comment mesurer les propriétés de la membrane et enregistrer l’activation rythmique des motoneurones avant, pendant et après la polarisation anodale ou cathodale de la moelle épinière.

Stimulation transspinale à courant continu du motoneurone spinal d'un rat

Cette vidéo présente un test basé sur un réseau de microélectrodes pour étudier l’activité des réseaux neuronaux dans des sections de moelle épinière de souris. Tout d’abord, l’activité électrophysiologique de la corne dorsale superficielle (SDH) de la tranche est enregistrée. Ensuite, un inhibiteur des canaux potassiques est introduit pour prolonger la dépolarisation, ce qui entraîne une activité rythmique synchrone sur l’ensemble du réseau neuronal.

Évaluation des réseaux neuronaux à l’aide d’un réseau de microélectrodes dans des coupes de moelle épinière de souris

L’enregistrement des courants Ca2+ au niveau de la membrane frontale de libération présynaptique est essentiel à une compréhension précise de l’entrée de Ca2+ et de la libération des neurotransmetteurs. Nous présentons une dissociation aiguë de la moelle épinière de la lamproie qui produit des axones réticulospinaux isolés fonctionnels, permettant l’enregistrement directement à partir de la membrane frontale de libération des terminaisons présynaptiques individuelles.

Aiguë de dissociation de la lamproie réticulo axones pour permettre l&#39;enregistrement de la sortie de visage membrane des terminaux présynaptiques fonctionnels individuels

L’efficacité de l’absorption intramusculaire et du transport rétrograde des molécules vers les motoneurones correspondants dépend de l’emplacement des sites d’injection par rapport aux plaques d’extrémité motrices (MEP). Ici, nous décrivons comment localiser les MEP sur les muscles squelettiques afin d’optimiser le transport rétrograde des traceurs dans les motoneurones.

Les injections intramusculaires le long des plaques motrices de fin: une approche minimalement invasive à la navette Tracers Directement dans motoneurones

Nous décrivons ici les étapes essentielles pour des enregistrements de patch-clamp de la cellule entière faites de neurones substantia gelatinosa (SG) dans la tranche de la moelle épinière en vitro . Cette méthode permet les propriétés membranaires intrinsèques, la transmission synaptique et la caractérisation morphologique des neurones de la SG à étudier.

Préparation de tranches médullaires aiguës pour l’enregistrement de Patch-clamp de la cellule entière dans les neurones de Substantia Gelatinosa

Ce protocole tant visuellement communique la préparation du tronc cérébral-moelle épinière et clarifie la préparation des tranches transversale du tronc cérébral d’une façon complète étape par étape. Il a été conçu pour accroître la reproductibilité et la probabilité d’obtenir des tranches viables, durables et rythmiquement actifs pour l’enregistrement de sortie neuronale des régions respiratoires du tronc cérébral.

Préparation de rythmiquement actifs In Vitro néonatale rongeurs tronc cérébral-moelle épinière et fine tranche

Ce protocole décrit l’enregistrement intracellulaire in vivo des motoneurons lombaires de rat avec la stimulation simultanée de courant direct trans-spinal. La méthode nous permet de mesurer les propriétés de la membrane et d’enregistrer le tir rythmique des motoneurons avant, pendant et après la polarisation anodale ou cathodale de la moelle épinière.

Enregistrement intracellulaire in vivo des motoneurones spinaux de rat identifiés par type pendant la stimulation trans-spinale à courant direct

L’intégration de diverses entrées synaptiques aux neurones est mieux mesurée dans une préparation qui préserve tous les noyaux pré-synaptiques pour le timing naturel et la plasticité du circuit, mais les tranches de cerveau coupent généralement de nombreuses connexions. Nous avons développé une tranche de cerveau modifiée pour imiter l’activité du circuit in vivo tout en maintenant la capacité d’expérimentation in vitro.

Préparation in vitro en tranches compensées pour imiter la connectivité du circuit neuronal In Vivo

L’utilisation combinée de la technologie des réseaux de microélectrodes et de la stimulation chimique induite par la 4-aminopyridine pour étudier l’activité nociceptive au niveau du réseau dans la corne dorsale de la moelle épinière est décrite.

Enregistrement de l’activité du réseau dans les circuits nociceptifs rachidiens à l’aide de réseaux de microélectrodes

Ce protocole décrit une méthode utilisant un patch-clamp pour étudier les réponses électriques des motoneurones à la stimulation de la moelle épinière (SCS) avec une résolution spatio-temporelle élevée, ce qui peut aider les chercheurs à améliorer leurs compétences en séparant la moelle épinière et en maintenant la viabilité cellulaire simultanément.

Préparation ex vivo d’une tranche de moelle épinière pour l’enregistrement d’un patch-clamp de cellules entières dans les motoneurones lors d’une stimulation de la moelle épinière

Apprenez à préparer des coupes obliques de moelle épinière chez la souris pour stimuler les racines ventrales. Cette technique permet d'identifier les motoneurones et d'étudier les cellules ventrales innervées par leurs collatérales axonales.

La Préparation de la moelle épinière Oblique tranches pour ventral Racine Stimulation

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