Effiziente Sporulation von

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, Hefe effizient im 96-Well-Format zur Sporulation zu bringen. Obwohl bereits viele großangelegte Untersuchungen an der Hefe durchgeführt wurden, waren Hochdurchsatzstudien zur Meiose und Sporulation bisher begrenzt. Die in diesem Video beschriebene Technik bietet den Vorteil, dass Hefe effizient und kostengünstig im 96-Well-Format gesporuliert werden kann, das mit Hochdurchsatz-Screenings kompatibel ist.

Die Idee zu dieser Methode hatte ich zunächst, weil ich eine gekachelte Plasmidbibliothek mit zwei Mikrometern verwenden wollte, um nach Hochkopiezahlen-Suppressoren eines Mutanten zu screenen, der keine lichtbrechenden Sporen bilden konnte. Anfangs waren meine Sporulationseffizienzen im 96-Loch-Format schlecht. Ich stellte fest, dass dies auf unzureichende Belüftung zurückzuführen war.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie den SK1-Hefestamm auf eine Hefe-Extrakt-Pepton-Glycerin- oder YPG-Platte auftauen. Verwenden Sie einen sterilen Stab, um eine kleine Menge Zellen aus dem Gefriervial mit dem Glycerinbestand abzukratzen, und verteilen Sie diese auf einer YPG-Platte. Kultivieren Sie die Hefe 12 bis 16 Stunden bei 30 Grad Celsius.

Als Nächstes streichen Sie die Hefe von der YPG-Platte auf eine Platte mit Hefeextrakt-Pepton-Dextrose, oder YPD, um einzelne Kolonien zu erhalten. Kultivieren Sie die Hefe 24 bis 48 Stunden bei 30 Grad Celsius auf der YPD-Platte. Beginnen Sie nach 24 bis 48 Stunden Wachstum auf festem YPD-Medium eine 25-Milliliter-YPD-Kultur unter Verwendung einer einzelnen Kolonie von der YPD-Platte.

Züchten Sie diese Kultur über Nacht in einem schüttelnden Inkubator bei 30 Grad Celsius und 220 U/min, bis die Zellen einen OD600 von 4,0 bis 7,0 erreichen. Verwenden Sie am folgenden Tag eine geeignete Menge Zellen aus der YPD-Kultur, um eine 125-Milliliter-Kultur in Hefeextrakt-Pepton-Acetat, oder YPA, mit einem OD600 von 0,1 anzusetzen. Züchten Sie die Kultur in einem schüttelnden Inkubator bei 30 Grad Celsius und 220 U/min, bis der OD600 zwischen 1,3 und 1,5 liegt.

Überführen Sie die Kultur in Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 1800×g in einer Tischzentrifuge, um die Zellen zu pelletieren. Waschen Sie die Zellen einmal mit einem halben Volumen steriler, autoklavierter, deionisierter Wasser. Zentrifugieren Sie erneut und entsorgen Sie das Wasser.

Suspendieren Sie die Zellen in einem 1X-Volumen an Sporulationsmedium. Um Zellen unterschiedlicher Genotypen vorzubereiten, werden Zellen aus aufgetauten Gefriervorräten in einer 96-Multiwell-Platte zunächst auf feste YPG-Medien übertragen. Sterilisieren Sie einen 96-Zinken-Frogger im Flamme und kühlen Sie ihn anschließend kurz auf einer Platte mit festem Medium ab, bevor Sie ihn mit den Hefe-Kolonien in Kontakt bringen.

Züchten Sie die Hefe über Nacht bei 30 Grad Celsius. Überführen Sie am folgenden Tag die Zellen von YPG-Festmedium auf YPD- oder selektives Festmedium, abhängig vom Genotyp des Stammes. In dieser Demonstration wird YPD verwendet.

Züchten Sie die Hefe bei 30 Grad Celsius, bis Kolonien für jeden Stamm gebildet sind. Portionieren Sie 1,2 Milliliter flüssiges YPD-Medium in jedes Loch einer 96er-Tieflochplatte. Übertragen Sie die Zellen vom festen Medium in flüssiges Medium.

Bedecken Sie die Platte mit einem Kunststoffdeckel von einer rechteckigen Petrischale und befestigen Sie den Deckel mit einem Stück Klebeband, um die Luftzirkulation minimal einzuschränken. Kultivieren Sie die Zellen über Nacht in einem Schüttelinkubator bei 30 Grad Celsius und 220 U/min. Am folgenden Tag zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 1800×g.

Geben Sie das Medium ab und fügen Sie 500 Mikroliter YPA zu jedem Well hinzu. Suspendieren Sie die pelletierten Zellen erneut. Bedecken Sie die Platte mit einem Kunststoffdeckel, der mit Klebeband fixiert wird.

Züchten Sie die Zellen 15 Stunden lang in einem schüttelnden Inkubator bei 30 Grad Celsius und 220 U/min. Um eine ausreichende Belüftung für eine effiziente Sporulation zu gewährleisten, geben Sie in jedes Loch einer 96-Loch-Platte entweder eine sterile, feste Glasperle mit drei Millimeter Durchmesser oder einen sterilen magnetischen Rührstab mit fünf Millimeter Länge und zwei Millimeter Durchmesser. Falls alle Zellen denselben Genotyp aufweisen, portionieren Sie 500 Mikroliter Zellen inklusive Medium in jedes Loch der 96-Mehrfachplatte.

Decken Sie die Platte mit einem Kunststoffdeckel ab, der mit Klebeband fixiert wird. Wenn die Zellen unterschiedliche Genotypen aufweisen, zentrifugieren Sie die Zellen in YPA bei 1800×g fünf Minuten lang und gießen Sie das Medium ab. Geben Sie 500 Mikroliter Sporulationsmedium in jede Vertiefung.

Und resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in dem Sporulationsmedium. Bedecken Sie die Platte mit einem Plastikdeckel, der mit Klebeband fixiert wird. Wenn Glaskügelchen verwendet werden, stellen Sie die Proben in einen schüttelnden Inkubator bei 30 Grad Celsius und schütteln Sie bei 220 U/min zur Sporulation.

Wenn magnetische Rührstäbchen verwendet werden, stellen Sie die Proben auf eine Rührplatte innerhalb eines 30 Grad Celsius warmen Inkubators zur Sporulation. Die genaue Drehzahl für die magnetischen Rührstäbchen ist nicht sehr wichtig, solange sich alle Stäbchen kräftig bewegen und die Kultur belüftet wird. 36 Stunden später entnehmen Sie die Proben, um den Fortschritt der Sporulation zu überwachen.

Entnehmen Sie sechs Mikroliter Zellen aus jeder sporulierenden Kultur und geben Sie sie zu 24 Mikrolitern Sporulationsmedium in einer 96-Well-Deckglasplatte hinzu. Lassen Sie die Zellen fünf Minuten lang sedimentieren, bevor Sie sie mit einem invertierten Mikroskop untersuchen. Eine repräsentative Sporulation zweier unterschiedlicher Stämme ist in diesen Bildern von Zellen dargestellt, die mit einem 63X-Objektiv an einem invertierten Mikroskop visualisiert wurden.

Lichtbrechende Tetraden, die durch die Pfeilspitzen markiert sind, sind in der Wildtyp-Kultur sichtbar. In der Kultur mit den spori­lations­unfähigen smk1-Löschmutanten hingegen nicht. Es wurden Vergleiche zwischen den Sporulationseffizienzen von Zellen angestellt, die in Mehr­fach­brunnenplatten gesporuliert wurden, und Zellen, die in größeren Volumina in Kolben gesporuliert wurden.

Die Verwendung von Mehrwell-Platten erreichte nicht die hohe Effizienz, die üblicherweise bei der typischeren Methode der Sporulation in Kolben beobachtet wird. Die Sporulation in Mehrwell-Platten mit geeigneter Belüftung kann jedoch ausreichende Sporulationseffizienzen von über 50 % erreichen, wobei die besten Ergebnisse mit einem fünf Millimeter langen Rührstab erzielt wurden. Angesichts der hohen Kosten der kleinen Rührstäbe sind die mit Glasperlen erzielten Effizienzen jedoch vergleichbar.

Obwohl sowohl 5 mm als auch 7 mm lange Rührstäbchen in die Vertiefung einer 96-Multiwellplatte passen, führte die Verwendung eines 7-mm-Rührstäbchens zu einer geringen Sporulationseffizienz. Das 7-mm-Rührstäbchen in einer Vertiefung neigt dazu, mit einem Rührstäbchen in einer benachbarten Vertiefung zu interagieren, wodurch verhindert wird, dass die Stäbchen ordnungsgemäß rühren und die Kultur ausreichend belüftet wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Hefezellen effizient in flüssiger Kultur im 96-Loch-Format sporuliert werden können. Wenn der Vorgang einmal beherrscht ist, kann er bei korrekter Durchführung innerhalb von sechs Tagen abgeschlossen werden. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um verschiedene Mutantenstämme, Plasmide oder kleine Molekülinhibitoren auf ihre Wirkung auf Meiose und Sporulation zu untersuchen.

Nach ihrer Entwicklung wurde diese Technik verwendet, um die Regulation des meiotischen Zellzyklus und die Kopplung von Zytokinese und Meiose bei der Sporulation in Saccharomyces cerevisiae zu untersuchen.