개 호중구 세포 외 트랩 릴리스의 정량화를위한 ​​간단한 형광 분석

이 실험의 전반적인 목표는 정지 호중구를 분리하고 작용제에 대한 반응으로 DNA 방출을 측정하는 것입니다. 이 방법은 호중구 세포외 트랩 유도 또는 세포 사멸의 다양한 작용제에 대한 호중구 반응은 무엇입니까? 이 기술의 가장 큰 장점은 호중구 세포 외 트랩 형성의 다양한 작용제 및 억제제를 신속하게 스크리닝할 수 있다는 것입니다.

건강한 개 기증자의 두부 정맥에 21게이지 나비 바늘을 삽입하는 것으로 시작한 다음 3ml 주사기를 부착하고 3ml 혈액 샘플 3개를 채취한 다음 즉시 샘플을 뚜껑이 없는 EDTA 함유 혈액 튜브로 옮깁니다. 정맥 천자가 외상성이 없고 혈류가 양호한지 주의해야 하며, 채혈이 불량하면 호중구 수율이 저하됩니다. 각 튜브를 채운 후 튜브를 뒤집어 혈액과 항응고제가 적절하게 혼합되도록 합니다.

50ml 원뿔형 튜브에 혈액을 모읍니다. 샘플을 부드러운 반전으로 동일한 부피의 멸균 실온 3%Dextran 500과 혼합하고 실온에서 18-20분 동안 튜브를 똑바로 세웁니다. 그런 다음 빨대 색의 상층을 아래쪽 빨간색 층에 의해 오염되지 않고 더 이상 수집되지 않을 때까지 새 튜브로 옮깁니다.

상층을 원심분리하십시오. 상등액을 버리고 펠릿을 10ml의 멸균 실온 PBS에 수동으로 재현탁합니다. 다음으로, 10ml의 실온 디아트리조산 나트륨 세포 분리 용액에 있는 폴리수크로오스를 50ml 원추형 튜브에 추가합니다.

분리 용액 위에 세포를 조심스럽게 겹쳐 놓습니다. 원심분리로 세포를 분리합니다. 상부 3개의 혈장과 혈소판 단핵 세포 및 밀도 구배층을 버립니다.

남은 적혈구를 실온의 물 10ml로 용해합니다. 30초 후 10ml의 멸균 실온 1.8% 염화나트륨을 첨가하여 강장제를 복원합니다. 부드러운 반전으로 세포를 혼합합니다.

이제 원심분리로 세포를 수집합니다. 흰색 펠릿을 10ml의 멸균 PBS에 부드럽게 재현탁합니다. 계수 후, 세포를 다시 원심분리하고 멸균 실온 PBS에서 10 - 밀리리터당 6번째 세포 농도의 5배로 펠릿을 재현탁합니다.

적절한 경우, 유리 슬라이드에서 소량의 세포를 자연 건조한 다음 제조업체의 지침에 따라 신속한 고정 및 염색 키트로 염색합니다. 호중구 분리가 성공적이었다면, 핵이 형성된 세포의 최소 95%는 광학 현미경 검사에서 관찰된 바와 같이 적혈구 오염이 최소화된 과립구여야 합니다. 호중구 분리 직후 멸균 70미크론 멸균 필터를 통해 세포 현탁액을 통과시키고 배양 배지가 포함된 96웰 플레이트의 테스트 웰에 4번째 세포에 5배 10을 추가하여 섭씨 39도 및 4% 이산화탄소에서 30분 동안 배양합니다.

세포가 부착되면 페놀 레드가 없는 RPMI에 대한 관심 작용제의 최종 부피 100-200 마이크로리터에 추가하고 열 비활성화 FCS를 테스트 웰에 보충하고 PBS만 포함하는 두 개의 빈 웰에 추가합니다. 그런 다음 적절한 세포 불투과성 핵산 염료를 세포에 추가하고 플레이트를 인큐베이터로 다시 넣습니다. 적절한 배양 기간이 끝나면 마이크로플레이트 리더에서 형광을 측정합니다.

혈소판 활성화 인자로 개 호중구를 1시간 동안 자극하면 대조군의 비자극 세포에 비해 형광이 평균 4배 증가합니다. 그러나 PMA는 활성화 2시간 전에 호중구 형광이 증가하지 않는 느린 작용제이지만 궁극적으로 시간이 지남에 따라 유사한 폴드 증가를 생성합니다. 핵산 염료 형광은 호중구 세포 외 트랩 형성에 특이적이지 않으며, 다른 메커니즘에 의한 세포 사멸이 있거나 시약이 DNA에 오염된 경우에도 발생하기 때문입니다.

예를 들어, 이 대표적인 실험에서 상업용 LPS 제제는 호중구가 없는 상태에서 매우 높은 형광을 생성했는데, 이는 아마도 박테리아 DNA의 오염으로 인한 것으로 추정됩니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 약 6시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 호중구를 부드럽게 다루는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

세포를 와류로 돌리지 말고, 상층액을 붓지 말고 피펫으로 제거하십시오. 이 절차에 따라 면역형광 현미경 검사와 같은 다른 방법을 수행하여 방출된 DNA가 NETosis와 관련이 있는지 확인할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 혈액학 분야의 연구자들이 응고에 방출된 DNA의 상호 작용과 환자 혈장을 포함한 새로운 NET 작용제의 효과를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 개 호중구를 분리하고 작용제에 대한 반응을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.