טעינת צבע סידן לתוך צפרדע עצב צפרדע דרך גדם עצב: סידן חולף הרשמה צפרדע Neuromuscular צפרדע

שלום, שמי דימיטרי סמיגולין אני עובד במעבדה לביופיזיקה של תהליכים סינפטיים של מכון קאזאן לביוכימיה וביופיזיקה, האקדמיה הרוסית למדעים. במעבדה שלנו אנו חוקרים דרכים נרחבות של איתות סידן בצומת העצבי-שרירי. אחת השיטות הנגישות ביותר למדידת רמת הסידן הסינפטית היא הקלטה אופטית.

כאן אנו מתארים את שיטת הטעינה של צבע רגיש לסידן, דרך גדם עצבי, בקצות העצבים של הצפרדע. כמו כן, אנו מציגים את הפרוטוקול למדידה וניתוח של חולף סידן עצום במסופי צפרדעים. בשיטה זו ניתן לחקור את השפעת התרופות הפעילות על הרמה הפרה-סינפטית של הסידן במהלך הפעילות הסינפטית.

הכנת תמיסת העמסת הצבע. צבע סידן של Fluorescein Oregon Green BAPTA, מגיע ב-500 מיקרוליטר באמצעות כמות קטנה של 500 מיקרוגרם אבקה. הוסף לאבקה 14 מיקרוליטר תמיסה, המכילה HEPES.

מערבולת תמיסת טעינה, וסובב למטה כדי לערבב היטב. עטפו את הבקבוקון בתמיסת הטעינה בנייר כסף, כדי למנוע חשיפת אור. אחסן את תמיסת הטעינה במינוס 20 מעלות צלזיוס, במקפיא.

הליך טעינת צבע. נתח שריר חזה עורי מהחיה. הרכיבו רקמה מנותחת בצלחת פטרי מרופדת בכסף.

מותחים את הרקמה בעזרת סיכות נירוסטה עדינות. הוסף את הפתרון של רינגר לצלחת הפטרי. בעזרת סכין גילוח חותכים חתיכה קטנה, כ -2 מילימטרים מצינור הפיפטה של עשרה מיקרוליטרים מהקצה הדק.

הכינו חתיכת פלסטלינה להחזקת פיפטת המילוי על צלחת הפטרי. חבר את פיפטת המילוי עם מזרק פלסטיק דרך צינור סיליקון ומתאמים עשויים צינורות פיפטה. הסר את תמיסת רינגר הזמנית מצלחת הפטרי על ידי פיפטה מפלסטיק.

הכנה יבשה עם מזרק. זה ימנע יניקה של התמיסה בפיפטה המילוי. מוציאים את הבקבוקון עם תמיסת טעינה מהמקפיא ומניחים להפשיר בטמפרטורת החדר במקום חשוך.

בעזרת פינצטה עדינה ומספריים, בשליטה חזותית, עם מיקרוסקופ סטרילי, חותכים את העצב קרוב לשריר. השאירו כשני מילימטרים של גדם עצבים. תקן את פיפטת המילוי בעזרת צינור והמזרק, על צלחת הפטרי בעזרת פלסטלינה.

הזז אותו קרוב לענף העצב. שאפו בעדינות את גדם העצב בפיפטה המילוי. הסר את צינור היניקה מהקצה הקהה של פיפטת המילוי.

יבש את גדם העצב בפיפטת המילוי על ידי המזרק. התקדם במעלה פיפטת המילוי עם גדם העצב. בודד את גדם העצב מבחוץ על ידי וזלין.

פעם נוספת, יבש את גדם העצב בפיפטה הממלאת על ידי המזרק. צייר את נקודת האפס חמישה מיקרוליטר של תמיסת טעינה באמצעות פיפטה עם קצה פיפטה ארוך. הכנס בעדינות את קצה הפיפטה עם תמיסת הטעינה לתוך פיפטת המילוי.

הוציאו את התערובת ישירות לגדם העצב. אטום את הקצה הפתוח של פיפטת המילוי באמצעות וזלין. הוסף כמות קטנה של תמיסה לצלחת הפטרי.

דגרו את התכשיר בטמפרטורת החדר במקום חשוך ורטוב למשך חמש שעות. לאחר הליך הדגירה, קח את התכשיר והסר את פיפטת המילוי עם תמיסת הטעינה. מניחים את התכשיר באמבטיה ושוטפים אותו עם התמיסה של רינגר.

שומרים את האמבטיה עם התכשיר למשך הלילה במקרר בטמפרטורת שמונה מעלות צלזיוס. הכן את הרקמה למיקרוסקופיה. קח את התכשיר מהאמבטיה.

הרכיבו את התכשיר בתא מרופד בכסף ומתחו מעט את הרקמה. שטפו את הטישו בתמיסת רינגר טרייה. קח את האלקטרודה לגירוי יניקה.

הנח את אלקטרודת יניקת הגירוי בתא כשקצהו קרוב לקצה החתוך של העצב. משוך את העצב אל האלקטרודה. בניית האלקטרודה מתוארת במאמרו של חזוקוף, קישור למאמר נמצא בחומרים.

תקן את תא ההכנה על במת המיקרוסקופ. הנח את בדיקת הטמפרטורה. חבר צינורות זרימה בכבל חשמל עבור אלמנט פלטייר בתא ההכנה.

הנח את צינור הזרימה בתא ההכנה. הפעל משאבת זלוף. הפעל את המונח יחידת בקר.

הגדר את הטמפרטורה ביחידת הבקר כך שתגיע ל-20 מעלות צלזיוס. התקן מגן הגנה אולטרה סגול. הגדר את משך ההשהיה ואת התקופה על הממריץ.

חבר חוט מאלקטרודת היניקה עם הממריץ. הפעל אותו. תחת יעד הגדלה נמוך, בדוק את התכווצות השרירים על ידי הפעלת הגירוי.

מלאו את מערכת הזילוף בתמיסת רינגר עם דל סידן ומגנזיום גבוה. הגדר את קצב הזלוף של כשני מיליליטר לדקה. החלף את המטרה בהגדלה פי 40.

הפעל את אורך גל הפליטה של Polychrome V.Select ותאורת מצב רציף. פתח את הצמצם. מתחת למטרת הגדלה פי 40, במצב פלואורסצנטי תאורות מבטיחות שהמסופים נטענים.

מצא את הטרמינל והתמקד בו. העצב הטעון ומסופי העצבים המוטוריים העמוסים היטב, מיוצגים באיור. צילום וידאו עם מצלמת Neuro CCD אדומה-קצרה.

הפעל את תוכנת Turbo-SM. בחר שנה הגדרות. מספר הקלט של המסגרות הוא 500.

הזן את שם הניסוי. התצורה הבסיסית היא 1000 פריימים לשנייה. 80 על 80.

בחר גורם מפעיל חיצוני. הזן זמן טרום טריגר. מינוס עשר אלפיות השנייה.

הזן מספר חזרות, 20. בתוכנת Polychrome, בחר מצב תאורת טריגר חיצוני. הפעל את תוכנת Clampex.

פרוטוקול גירוי עומס. הפרוטוקול זמין להורדה מדף המעבדה שלנו באתר האוניברסיטה הפדרלית של קאזאן. לפני ההקלטה צלם מסגרת כהה בתוכנת Turbo-SM.

בקובייה המשולשת בחר רמות חילופי נתיב אור. 100 אחוז למצלמה. הפעל את פרוטוקול הגירוי.

בחר את אזור העניין ובדוק את האות. בתגובה לגירוי העצבי אנו רושמים שינוי בעוצמת הקרינה המשקפת את כניסת הסידן לקצה העצב. ניתוח נתונים.

בתוכנת Turbo-SM, בחר file. לאחר מכן, בחר, קבצים ממוצעים. בחר קבצים.

הזן את שם הקובץ הממוצע וממוצע אותם. שמור את הקובץ הממוצע כקובץ מתאים. בחר, שמור כקובץ מתאים.

הזן את שם הקובץ ושמור אותו. הפעל את תמונה J ופתח את המכשירים למטה. ניתוח, כלים, מנהל ROI.

מצא קובץ ממוצע שמור בפורמט מתאים. גרור ושחרר אותו לתמונה J.הגדל את החלון לתצוגה טובה יותר. בחר אזור עניין מלבני על פני מה שאתה מאמין שהוא רקע.

הוסף אותו למנהל החזר ההשקעה. במנהל החזר ההשקעה, בחר עוד. רב מדידה. טען למטה אמצעי.

העתק נתונים, ייצא ל- Excel. ב- Excel, השתמש בפונקציה average כדי לחשב ערך ממוצע של רקע עבור יחס. מבלי לסגור את Excel, חזור לתמונה J.סגור את החלון עם חישוב רקע מבלי לשמור.

השתמש במנהל החזר ROI, מחק ציור רקע מלבני. תהליך כלי פתוח, מתמטיקה, חיסור. הזן ערך ממוצע מחושב של סף מ- Excel והחסר את הקרקע מערימות.

בחר אזור עניין מלבני סביב מסוף עצבים. הוסף אותו למנהל החזר ההשקעה. במנהל החזר ההשקעה, בחר, עוד, רב-מדידה, טען למטה, ממוצע.

העתק והדבק בחלון Excel. השתמש בגרף עלילת מכשיר של Excel. בחר אזור שטוח לפני תחילת האות.

טען את הגרף עם הפרטים מהערכים הראשונים של הקרינה במנוחה, לתחילת האות. לאחר מכן קבע את מספר הנקודות לערכי הקרינה הממוצעים במנוחה. ממוצע ערכים אלה, ואז מצא את המספר הממוצע של הקרינה בשאר.

חלקו אותות לפי הקרינה במנוחה. הפחיתו אחד והכפילו ב-100 אחוז. שרטט את האות וחשב את משרעת הסידן החולף.

פרמטרי זמן של אותות פלואורסצנטיים תלויים במהירות התגובות קדימה או אחורה של היווצרות קומפלקס סידן-צבע. זמן העלייה של אות הסידן מייצג דינמיקה של קלט סידן. זה דיפוזיה בטרמינל, ואינטראקציה של סידן עם צבע.

דעיכת הסידן החולף תלויה בזיקה לצבע ובקצב חציצה של סידן ונסיגתו. ניתן להשתמש בניתוח של משרעת חולפת סידן כדי לחקור את ההשפעה של חומרים פעילים שונים על כניסת הסידן המשתתפים בשחרור נוירוטרנסמיטרים. טכניקת העמסה זו מתאימה היטב להדמיה של שינויים בסידן ציטוזומלי.

עם אינדיקטורים פלואורסצנטיים וגירוי עצבי בודד ופעילות סינפטית קצבית. ניתן להשתמש בניתוח של משרעת חולפת סידן כדי לחקור את ההשפעה של חומרים שונים על כניסת סידן המשתתפת בשחרור נוירוטרנסמיטרים. יש כמה נקודות חשובות שאנחנו רוצים לשים לב אליהן.

הליך הדגירה כולל שני שלבים. דגירה בטמפרטורת החדר, ובמקרר. חשוב לשלוט על זמן הדגירה עם הצבע בטמפרטורת החדר.

בהתאם לאורך גדם העצב, הצבע והטמפרטורה בחדר, זמן הדגירה עשוי להשתנות. אם אתה חושף יתר על המידה את המסופים והחלקים הפרוקסימליים לפני הניתוח, קרוב לגדם העצבים, ניתן להעמיס יתר על המידה. בשל הדגירה הארוכה במקרר, הצבע מופץ באופן שווה לאורך קצות העצבים.

חיוני למקם את העצב בתמיסת העמסת הצבע, תוך מספר דקות לאחר החיתוך, כדי לאפשר לצבע להיכנס לעצב, מכיוון שמרווחי זמן ארוכים יותר יצרו טעינה לא יעילה, ככל הנראה עקב קבלת עצב סגור. כדי להפחית את מידור הצבע ניתן להשתמש בצורה המורחבת של הצבע. חשוב מאוד למנוע את התאורה הפלואורסצנטית הארוכה של הרקמה מכיוון שהיא משפיעה על הישרדותה.

אנו משתמשים באופטיקה של נומרסקי בערוץ האור הנראה כדי לחפש את המסופים. במהלך ההקלטה אנו מגבילים את התצוגה המוארת, על ידי הסרעפת. ניתן להפחית את משך הזמן הארוך של תהליך הטעינה באמצעות חותמת תריס של העצב.

במקרה זה, ניתן להשתמש במיקרו-מעקף זכוכית.