שיטת הדגימה ספוגית לצורך זיהוי של norovirus האדם על משטחים

המטרה הכוללת של שיטת דגימת פני השטח המבוססת על קצף מאקרו שלנו היא לזהות אטיולוגיה של התפרצות, הערכה כוללת של דינמיקת הזיהום הסביבתי של הנגיף ויעילות אסטרטגיות תיקון לנורו-וירוס. פרוטוקול זה פירט כיצד לאסוף דגימת מטוש מפני השטח הסביבתי וכיצד יש לאחסן ולהוביל את המטושים הללו, ואיזה פרוטוקול מעבדה מומלץ לאיתור והקלדה של הנורו-וירוס ממטושים אלה. שיפורים ברורים של פרוטוקול מטוש סביבתי זה עבור נורו-וירוסים הוא שקבענו את הסוג הטוב ביותר של חומר ספוגית, כמה נורו-וירוס ניתן לשחזר ממשטחים קשים, וכי ניתן להשתמש בפרוטוקול ביעילות כדי לדגום שטחי פנים גדולים יותר.

בסרטון זה, שניים ממדעני הצוות שלי, גון וו פארק ופריטי צ'אברה ידגימו את פרוטוקול המטושים לזיהוי והקלדה של נורו-וירוסים. כדי להתחיל במטוש, המשיכו לאזור הדגימה והזיזו את המקלון על פני אזור הדגימה בקו אחד בכיוון האופקי, קו אחד בכיוון האנכי וקו אחד בכיוון האלכסוני. הנח כל ספוגית בצינור נפרד והדק את המכסה היטב.

דגמו משטחים עם נירוסטה, דגמו משטח מושב אסלה ודגמו ידית דלת. לאחר מכן, סמן צינור אחד של 15 מיליליטר ועמודת RNA Midi אחת עבור כל דגימה. כלול בקרת מיצוי שלילית בכל ניסוי.

הכן בקבוק ריק לאיסוף מיצוי חומצות גרעין אוניברסלי או UNEX, פסולת חיץ. כדי להכין את תמיסת הליזיס ל-10 ספוגיות, מערבבים 25 מיליליטר של מאגר UNEX עם 25 מיליליטר PBST. הוסף 50 מיקרוליטר של תרחיף קוליפג' MS2 ל-50 מיליליטר של תמיסת ליזה.

מניחים ספוגית בצינור של 15 מיליליטר, ומוסיפים חמישה מיליליטר תמיסת ליזה. מערבבים את הספוגית בתמיסה, ודוגרים את התערובת בטמפרטורת החדר. הוסף חמישה מיליליטר של 100% אתנול לכל צינור, וסובב את הצינורות למשך 10 שניות.

הסר בזהירות את הספוגית מהצינור של 15 מיליליטר, לחץ אותו בעדינות על דופן הצינור כדי להסיר עודפי נוזלים, ולאחר מכן השליך את הספוגית. העבירו בזהירות 4.5 מיליליטר מתערובת האתנול UNEX על עמוד מידי, וצנטריפוגה את העמוד. לאחר צנטריפוגה, השליכו את המסנן.

טען עוד 4.5 מיליליטר מאותה תערובת על אותו עמוד, ואז צנטריפוגה את העמוד. השליכו את המסנן. לשטיפה הראשונה, הוסף 3.5 מיליליטר של אתנול 70% על עמוד המידי, וצנטריפוגה את העמוד.

לאחר הסיבוב, השליכו את המסנן. לכביסה השנייה, הוסף עוד 3.5 מיליליטר של 70% אתנול לעמוד מידי. צנטריפוגה והשליכו את המסנן.

לסיבוב היבש, צנטריפוגה את עמודי המידי כדי להסיר את כל עקבות האתנול. הנח את עמוד המידי בצינור צנטריפוגה חדש של 15 מיליליטר. הוסף 250 מיקרוליטר של מאגר פליטה לעמודת ה-Midi, והמתן דקה אחת לפני הצנטריפוגה כדי להשיג את התאוששות ה-RNA הגבוהה ביותר לנגיפי.

הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר קשירת RNA ל-250 מיקרוליטר RNA, ומערבל את התערובת למשך 10 שניות. הוסף 750 מיקרוליטר של 100% אתנול, ומערבולת למשך 10 שניות. לאחר מכן, סמן עמודת ספין עבור כל דגימה.

טען את הדגימה של 750 מיקרוליטר על עמוד ספין, וצנטריפוגה את עמודות הסיבוב. השליכו את הזרימה. טען את 750 המיקרוליטר הנותרים על עמוד ספין, וצנטריפוגה את העמודים.

לשטיפה המוקדמת, הוסף 400 מיקרוליטר של מאגר הכנת RNA לכל עמוד ספין, וצנטריפוגה את העמודה. השליכו את הזרימה. לכביסה הראשונה, הוסף 800 מיקרוליטר של מאגר שטיפת RNA לכל עמוד סיבוב, וצנטריפוגה את העמודים.

השליכו את הזרימה. לכביסה השנייה, הוסף 400 מיקרוליטר של מאגר שטיפת RNA לכל עמוד סיבוב, וצנטריפוגה אותם. השליכו את הזרימה.

עבור הסיבוב היבש, צנטריפוגה את עמוד הסיבוב כדי להסיר את כל עקבות מאגר הכביסה. העבירו בזהירות את עמוד הסיבוב לצינור מיקרו-צנטריפוגה נקי בנפח 1.5 מיליליטר. הוסף 25 מיקרוליטר של מאגר פליטה על עמוד הספין, ודגר את העמודה למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר כדי להגביר את התאוששות ה-RNA הנגיפי מהעמודה.

אסוף את ה-RNA על ידי צנטריפוגה של עמודת הספין ב-10, 000 פעמים G למשך דקה אחת. המשך ישירות ל-PCR בזמן אמת. לפני שתמשיך עם RTPCR מולטיפלקס בזמן אמת, נקה משטחי עבודה, פיפטות וצנטריפוגות עם תמיסת טיהור RNase.

הפשירו ריאגנטים של PCR בזמן אמת על קרח. להפשיר את ה-RNA הדגימה על קרח באזור נפרד. קבע את מספר התגובות, והכין לפחות 10%יותר מגיב לתערובת המאסטר כדי לשלוט בהפסדים במהלך הפיפטינג.

לאחר מכן, מערבל את רכיבי תערובת המאסטר הבודדים למשך חמש שניות. מערבבים בזהירות את האנזים על ידי לחיצה על הצינור. צנטריפוגה קצרה של רכיבי תערובת המאסטר למשך חמש שניות.

לאחר מכן, הכינו את תערובת המאסטר לזיהוי RTPCR של נורו-וירוס G1 ו-G2 בהתאם להוראות הערכה, והוסיפו פריימרים ובדיקות אוליגונוקלאוטידים ספציפיים לנורו-וירוס בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, מערבבים את תערובת המאסטר על ידי פיפטינג שבע פעמים למעלה ולמטה. יש לערבב 22 מיקרוליטר של המאסטר לכל באר של צלחת ה-PCR בזמן אמת.

מערבל את ה-RNA הדגימה למשך חמש שניות, ואסוף את התוכן על ידי צנטריפוגה של חמש שניות. הוסף שלושה מיקרוליטרים של בקרות חיוביות של RNA לדוגמה ודילול סדרתי פי 10 של תעתיקי RNA G1 ו-G2 ללוחית ה-PCR בזמן אמת. הוסף שלושה מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז לבקרת תבנית הצומת, או בארות NTC.

אטום את הצלחת עם סרט דבק אופטי. צנטריפוגה בזהירות את הצלחת ב-1, 300 פעמים G למשך דקה אחת כדי להסיר בועות אוויר או טיפות נוזלים שעלולות להיות בבארות. לאחר מכן, הגדר את ה-PCR בזמן אמת והיכנס לתנאי הרכיבה התרמית.

קבע את העקומות הסטנדרטיות הן עבור תעתיקי G1 והן עבור תעתיקי G2. המר את ערכי ה-Ct לעותקי RNA באמצעות העקומה הסטנדרטית המתאימה. קח את היחס בין נפח נוזל ה-RNA הכולל לכמות ה-RNA הכוללת המשמשת לבדיקה בזמן אמת כדי לחשב את המספר הכולל של עותקי RNA לדגימה.

כדי לגנוטיפ את הדגימות החיוביות לנורו-וירוס באמצעות RTPCR קונבנציונאלי מקונן, הכינו תחילה תערובת מאסטר לסיבוב הראשון, והפיצו 20 מיקרוליטר בצינורות PCR מסומנים מראש. הוסף חמישה מיקרוליטר RNA לכל צינור. לאחר השלמת הסיבוב הראשון של RTPCR, הכינו תערובת מאסטר לסבב ה-PCR השני המקונן על ידי חלוקת כמויות של 23 מיקרוליטר לצינורות חדשים.

לבסוף, הוסף שני מיקרוליטר של מוצר ה-PCR העגול הראשון לכל צינור. שיטת דגימת המטושים המבוססת על קצף מאקרו נבדקה בשטח על דגימות שנאספו מספינת תענוגות שדיווחה על מקרים של חשד לגסטרואנטריטיס נורו-וירוס. ארבע מתוך 17 דגימות המטושים החיוביות לנורו-וירוס ניתנות לגנוטיפ, ולכל הדגימות היו רצפי G2 זהים.

קביעת העומס הנגיפי אפשרה להעריך משטחים שהיו מזוהמים מאוד, כגון מושבי אסלה. הקשר בין סף המחזור, או ערכי Ct, נקבע על ידי RTPCR בזמן אמת ביכולת לרצף דגימות אלה. בסך הכל, 127 מתוך 217 דגימות מטוש נמצאו חיוביות לנורו-וירוס G2.

דגימות מטוש עם ערכי Ct בין 24 ל-27 ובין 28 ל-31 נבדקו בשיעורים של 100% ו-72.2% בהתאמה. לעומת זאת, רק 22% ו-1.6% מדגימות המטושים עם ערכי Ct בין 32 ל-36 ו-37 עד 40 רוצפו בהצלחה. כפי שהדגמנו, פרוטוקול זה מאפשר לקבוע את רמת הזיהום הסביבתי במהלך התפרצויות נורו-וירוס, לזהות את הגורם האפשרי להתפרצות כאשר דגימות קליניות אינן זמינות, וגם, לקבוע את יעילות שיטות הניקיון.

לקבלת התוצאה המדויקת ביותר, חשוב מאוד לעקוב אחר פרוטוקול זה במדויק כדי למזער את שונות התוצאות בין הדגימות השונות.