Name: Un dispositif pour effectuer la migration cellulaire / Wound Healing dans une plaque à 96 puits (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Apprenez à quantifier la migration cellulaire avec un dispositif mécanique à huit canaux dans une plaque 96 puits. Cette méthode semi-haut débit permet d'évaluer rapidement les effets des traitements sans équipement coûteux.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs tiennent à remercier M. Tam Po Leung, M. Wong Chi Kin et le personnel technique de la Faculté des sciences Atelier, Hong Kong Baptist University, pour leurs compétences techniques et des conseils pour rendre le prototype de ce wounder.

1. Introduction aux parties du wounder (Figure 1) <ol><li> Préparer le porte-broche en fixant les broches blessantes à des distances égales. Tenez les embouts de pipette et d&#39;ajuster la hauteur de la pointe en déplaçant les broches blessantes réglables de haut en bas. </li><li> Monter le guidage-bar ajustable sur différentes marques de plaques de culture de 96 puits et de veiller à ce que la zone de la blessure est dans une position fixe. </li><li> Fixer la tige de blessure réglable en serrant la vis à tête hexagonale. Fixer la barre de guidage en position en serrant la tête bouchons à six pans creux sur les deux extrémités. </li></ol> 2. Réglage de la largeur du titulaire Pin (Figure 2) <ol><li> Desserrez les bouchons de tête à six pans creux avec la clé hexagonale M5. </li><li> Insérer un nombre approprié de bagues de réglage sur les deux côtés du porte-broches de sorte que les barres de guidage correspondent parfaitement à la largeur de la plaque de culture à 96 puits. NOTE: Corning et plaques Iwaki nécessite 1 paire de grands anneaux et 1 paire de petits anneaux. Falcon et Nunc plAtes besoin 1 paire de grands anneaux. </li><li> Serrer la tête de douille hexagonale bouchons pour fixer la barre de guidage. </li></ol> 3. Réglage des barres de guidage (Figure 3) <ol><li> Monter les goupilles blessant avec 10 ul embouts de pipette en plastique stériles. </li><li> Desserrez les bouchons de tête à six pans creux avec la clé hexagonale M5. </li><li> Tenez le wounder et tremper les tiges blessantes dans une colonne d&#39;une plaque de culture à 96 puits. </li><li> Réglez la hauteur des barres de guidage jusqu&#39;à ce que tous les conseils à peine toucher le fond des puits. </li><li> Serrer les bouchons de tête à six pans creux. Assurez-vous que le wounder maintenant correspond parfaitement sur la plaque de culture et que les broches sont bien placés dans le milieu des puits. </li></ol> 4. Calibrage des Pins <ol><li> Tenir la wounder perpendiculaire à une surface stérile plat (c. -à -boîte de Pétri) et desserrer toutes les vis à tête hexagonale avec la clé hexagonale M3. </li><li> Appuyez sur le wounder jusqu&#39;à ce que tous les conseils uniformément toucher la surface stérile plat. &lt;/ Li&gt; <li> Serrer les vis à tête hexagonale à nouveau pour verrouiller les broches en position. </li><li> Vérifier la planéité de chaque pointe en appuyant sur le wounder doucement sur la surface stérile plat. </li></ol> 5. Scratching monocouche de cellules (Figure 4) <ol><li> Seed cellules ombilicales humaines endothéliales vasculaires sur une plaque à 96 puits revêtu de gélatine à 0,1% de la culture cellulaire. les cellules de culture en milieu 199 supplémenté avec 20% de sérum inactivé à la chaleur de fœtus bovin, 1% de pénicilline / streptomycine et 0,09 g / L de l&#39;héparine. Maintenir les cellules dans un incubateur humidifié avec 5% de dioxyde de carbone à 37 ° C pendant une nuit avant d&#39;être utilisé. Les cellules doivent atteindre 100% de confluence avant blessant. </li><li> Placer les pointes blessantes à l&#39;extrême gauche (ou droite) latérale de chaque puits dans la même colonne de la plaque de culture. Faites glisser le wounder travers de l&#39;autre côté du puits; assurez-vous que les conseils blessantes touchent le fond du puits. </li><li> Répétez le grattage (étape 5.2) pour toutes les colonnes. </li><li> Après la blessure, défausse til milieu de chaque puits et le remplacer par un milieu contenant des composés d&#39;essai frais. </li></ol> Acquisition de données 6. et analyse d&#39;images <ol><li> L&#39;ensemble d&#39; image bien avec la blessure mécanique sur la monocouche cellulaire en utilisant un microscope de faible puissance avec un appareil photo numérique (par exemple un objectif 10X) immédiatement après la blessure (t = 0 h). </li><li> Ajouter des composés d&#39;essai, si désiré et laisser incuber pendant la durée souhaitée. L&#39;ensemble d&#39;image bien avec la surface de la plaie à nouveau après le temps d&#39;incubation désirée (t = Dh). </li><li> En utilisant l&#39; image des logiciels d&#39;analyse tels que ImageJ ( <a href="https://imagej.nih.gov/ij/">https://imagej.nih.gov/ij/</a> ), mesurer la zone blessée sur l&#39;image en utilisant l&#39;outil à main levée. </li><li> Calculer le pourcentage de fermeture de la plaie: <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55411/55411eq1.jpg" /></li></ol>

<ol><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li>
<li>Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prespecification+and+plasticity%3A+shifting+mechanisms+of+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Prespecification and plasticity: shifting mechanisms of cell migration.</a> Curr Opin Cell Biol. 16 (1), 14-23 (2004).</li>
<li>Lampugnani, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+into+a+wounded+area+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell migration into a wounded area in vitro.</a> Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).</li>
<li>Sholley, M. M., Gimbrone, M. A. Jr, Cotran, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+migration+and+replication+in+endothelial+regeneration%3A+a+study+using+irradiated+endothelial+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Cellular migration and replication in endothelial regeneration: a study using irradiated endothelial cultures.</a> Lab Invest. 36 (1), 18-25 (1977).</li>
<li>Gotlieb, A. I., Spector, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+into+an+in+vitro+experimental+wound%3A+a+comparison+of+porcine+aortic+endothelial+and+smooth+muscle+cells+and+the+effect+of+culture+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Migration into an in vitro experimental wound: a comparison of porcine aortic endothelial and smooth muscle cells and the effect of culture irradiation.</a> Am J Pathol. 103 (2), 271-282 (1981).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+migration+chip+for+chemotaxis-based+microfluidic+selection+of+heterogeneous+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations.</a> Sci Rep. 18 (5), 9980(2015).</li>
<li>Yarrow, J. C., Periman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+cell+migration+assay+using+scratch+wound+healing%2C+a+comparsion+of+image-based+readout+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparsion of image-based readout methods.</a> BMC Biotechnol. 4, 21(2004).</li>
<li>Lauder, H., Frost, E. E., Hiley, C. R., Fan, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+repair+process+involved+in+the+repair+of+a+cell+monolayer+using+an+in+vitro+model+of+mechanical+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Quantification of the repair process involved in the repair of a cell monolayer using an in vitro model of mechanical injury.</a> Angiogenesis. 2 (1), 67-80 (1998).</li>
<li>Yue, P. Y. K., Leung, E. P. Y., Mak, N. K., Wong, R. N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+quantifying+cell+migration%2F+wound+healing+in+96-well+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A simplified method for quantifying cell migration/ wound healing in 96-well plates.</a> J. Biomol Screen. 15 (4), 427-433 (2010).</li>
<li>Yue, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+the+mechanisms+underlying+the+angiogenic+effects+of+ginsenoside+Rg%281%29+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Elucidation of the mechanisms underlying the angiogenic effects of ginsenoside Rg(1) in vivo and in vitro.</a> Angiogenesis. 8 (3), 205-216 (2005).</li>
<li>Kwok, H. H., Chan, L. S., Poon, P. Y., Yue, P. Y., Wong, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ginsenoside-Rg1+induces+angiogenesis+by+the+inverse+regulation+of+MET+tyrosine+kinase+receptor+expression+through+miR-23a%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ginsenoside-Rg1 induces angiogenesis by the inverse regulation of MET tyrosine kinase receptor expression through miR-23a.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 287 (3), 276-283 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Notre wounder cellulaire a plusieurs caractéristiques uniques pour résoudre les problèmes des tests traditionnels de migration cellulaire. La wounder mécanique à 8 canaux cellule est réalisée en acier inoxydable de haute qualité (acier 304) avec une longue durée de vie qui peut être stérilisé par autoclavage. Presque toutes les marques commerciales de plaques de culture à 96 puits disponibles sur le marché peuvent être utilisés avec ce wounder mécanique des cellules en raison de la barre de guidage réglable. La concepti...

La migration cellulaire joue un rôle important dans les processus cellulaires, tels que l&#39; embryogenèse, la neurogenèse, l&#39; angiogenèse, la cicatrisation, la réparation des muqueuses, épithélio-mésenchymateuse transitions en cours de développement normal et la situation de la maladie 1. Il est un processus complexe qui implique la coordination de nombreux événements internationaux et intra-cellulaires , y compris la signalisation des interactions moléculaires, la polarisation de la cellule, la réorganisation du cytosquelette, remodelage de la matrice, protrusion de la membrane et cellule-cellule dynamique adhérence modulation 2. En étudiant la migration cellulaire, la découverte et la validation des produits chimiques ou des biomolécules conduisant à un mouvement cellulaire et les voies biochimiques apparentées peuvent être déterminées. Ce processus fondamental peut être utilisé avantageusement en tant que proxy pour diverses applications, telles que le traitement de la maladie et le ciblage de médicaments. L&#39;essai est blessant l&#39; un des essais de migration cellulaire 3. Ici, unéchantillon individuel de cellules sera partiellement éliminé par des moyens mécaniques pour produire une zone dénudée où les cellules migrent pour couvrir la zone. Le pourcentage de récupération à un point de temps particulier sera surveillé. Lors de la manipulation grand nombre d&#39;échantillons, des questions telles que le coût expérimental et la contamination croisée dans les échantillons peuvent être problématiques. Bien que de nombreux outils commerciaux et des essais sont disponibles pour l&#39; étude de la migration des cellules 4, 5, 6, beaucoup d&#39;entre eux nécessaire un équipement coûteux et sophistiqué et des améliorations sont encore nécessaires. Pour ces raisons, un wounder cellulaire mécanique à 8 canaux (figure 1) est développée. Notre wounder mécanique 8 canaux cellulaire a incorporé plusieurs caractéristiques uniques pour résoudre les problèmes mentionnés ci-dessus. Il offre la possibilité d&#39;effectuer la migration des cellules / blesser les dosages dans le format de plaque de culture à 96 puits. Le réglage gubar design Iding veille à ce que la zone de zéro est dans la position centrale de chaque puits. En outre, la hauteur des barres de guidage peut être ajustée de sorte que la wounder est applicable pour les différentes marques de plaques de culture. Enfin, la conception de la broche de blessure réglable permet un contact même des pointes de pipette à la surface de la plaque de culture pour obtenir une blessure simultanée et reproductible 7, 8.

<table><tbody><tr><td>Plaque de culture cellulaire à 96 puits</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td>D’autres marques de plaque de culture cellulaire à 96 puits peuvent également être utilisées</td></tr><tr><td>Pointes de pipette P10</td><td>Axygen</td><td>301-03-051</td><td>La pointe de pipette courte P10 est plus facile à créer une plaie claire</td></tr><tr><td>Wounder</td><td>R& P Technology Limited</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma</td><td>M2520-1L</td><td>Pour la culture cellulaire de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine. Utiliser un milieu de culture approprié et une condition pour d’autres types de cellules.</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td>Pour la culture cellulaire de cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine. Utiliser un milieu de culture et une condition appropriés pour d’autres types de cellules.</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Pour la culture cellulaire de cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine. Utiliser un milieu de culture et une condition appropriés pour d’autres types de cellules.</td></tr><tr><td>Sel d’héparine sodique de la muqueuse intestinale porcine</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td>Pour la culture cellulaire de cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine. Utiliser un milieu de culture approprié et des conditions pour d’autres types de cellules.</td></tr><tr><td>Gélatine de peau bovine</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td>Pour la culture cellulaire de cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine. Utiliser un milieu de culture et une condition appropriés pour d’autres types de cellules.</td></tr></tbody></table>

un dispositif pour effectuer la migration cellulaire / wound healing dans une plaque à 96 puits

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

La migration cellulaire / blessure dosage est une méthode couramment utilisée pour étudier la migration cellulaire et d&#39;autres processus biologiques tels que l&#39;angiogenèse et les métastases tumorales. Dans cet essai, les cellules sont cultivées pour former une monocouche confluente et une blessure mécanique est créée par grattage avec un périphérique. Ensuite, le taux des cellules vers la zone dénudée de migration peut être surveillé par imagerie. Notre wounder mécanique à 8 canaux est conçu pour traiter la plupart des problèmes liés à la détermination de la migration cellulaire. Tout d&#39;abord, notre wounder peut être facilement stérilisé par autoclavage ou avec des désinfectants courants. Deuxièmement, les broches individuels réglables permettent même le contact avec la plaque de culture cellulaire de telle sorte que les plaies vives et reproductibles peuvent être créés. Troisièmement, les barres de guidage des deux côtés de la position de wounder assurent une blessure constante dans chaque puits. L&#39;utilisation de jetables conseils de pipette en plastique pour blesser peut en outre assurer une meilleure gestion de la wounder ainsi que pour minimiser les contre-contamination. En conclusion, notre wounder cellulaire peut fournir aux chercheurs un dispositif convivial et reproductible utilisateur pour effectuer le test de migration des cellules en utilisant la plaque standard de culture de 96 puits.

Cette wounder mécanique 8 canaux est construit de façon à gratter une monocouche cellulaire afin d&#39;effectuer le test de migration des cellules. Il est un dispositif convivial qui peut effectuer des essais grattage de cellules dans des plaques à 96 puits en moins d&#39;une minute sans formation spéciale. Ce wounder peut introduire des zones enroulées sur des monocouches de cellules avec une largeur uniforme d&#39;environ 600 pm et présentant des arêtes vives (figures 5</strong...

Ici, nous présentons un protocole pour effectuer un test de migration des cellules semi-haut débit sur une plaque de culture cellulaire de 96 puits. Ce protocole est une méthode rapide, simple et économique pour créer des blessures à gratter cohérentes sur une monocouche cellulaire.

Un dispositif pour effectuer la migration cellulaire / Wound Healing dans une plaque à 96 puits

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

L'objectif général de ce bobineur mécanique de cellules à huit canaux est de quantifier l'effet d'un traitement sur la migration cellulaire à l'aide du test de cicatrisation des lésions, de manière rapide et semi-haute performance, sans recourir à des équipements coûteux et complexes. La migration cellulaire est un processus cellulaire important dans diverses conditions physiologiques et pathologiques. Les tests in vitro de cicatrisation des lésions sont utilisés dans diverses études, notamment en cancérologie, en recherche cardiovasculaire et en dermatologie.Le principal avantage de cette méthode est que l'effet sur la migration cellulaire peut être surveillé sur une plaque à 96 rails, permettant d'observer simultanément différentes conditions de traitement. La procédure sera démontrée par Ka Chun Ng, étudiant diplômé de notre laboratoire. Pour commencer l'expérience, préparez le porte-épingles en fixant les épingles de blessure à des distances égales.Tenez les embouts de pipette et déplacez les broches de blessure réglables vers le haut et vers le bas afin d'ajuster la hauteur des embouts. Ensuite, fixez la barre de guidage réglable sur différentes marques de plaques de culture e

a-device-for-performing-cell-migrationwound-healing-in-a-96-well-plate

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Couramment utilisés, des méthodes très accessibles pour examiner la migration cellulaire et l'invasion in vitro sont décrits. La première méthode est la fermeture de la plaie dosage de cellules qui mesure la motilité cellulaire. La deuxième méthode est la migration et l'invasion essai transwell qui évalue la capacité chimiotactique et invasif des cellules.

Dans la migration cellulaire in vitro et Invasion dosages

MRP4 réglemente les divers événements de signalisation nucléotidiques dépendant cycliques, y compris un rôle récemment élucidé dans la migration cellulaire. Nous décrivons une approche directe, mais à multiples facettes pour démêler les cibles moléculaires en aval de MRP4 aboutissant à l'identification d'un interactome MRP4 unique qui joue un rôle clé dans la régulation de fine de la migration des fibroblastes.

Méthodes pour l&#39;étude de complexes macromoléculaires contenant MRP4 dans le règlement du fibroblaste Migration

Ce protocole vise à évaluer l’effet des facteurs pro - et anti - migratory sur la migration cellulaire dans une matrice de fibrine en trois dimensions.

Caractérisation de la Migration cellulaire dans les trois dimensions In Vitro plaie environnements

Cette étude rend compte de deux méthodes différentes pour l’analyse de l’invasion cellulaire et migration : le test de chambre de Boyden et l’essai in vitro vidéo axée sur le microscope cicatrisation avec. Les protocoles de ces deux expériences sont décrites, et leurs avantages et leurs inconvénients sont comparés.

Évaluation de l’Invasion des cellules et le processus de Migration : une comparaison de la rayure axée sur le Microscope vidéo blessure test et le test de chambre de Boyden

Ce manuscrit décrit comment incision-comme des lésions sur des monocouches de cellules épithéliales cultivées idéalement modèle embobiné guérison in vitro, permettant pour l’imagerie confocale ou microscopie à balayage de laser, et qui peuvent fournir de haute qualité données quantitatives et qualitatives pour l’étude de comportement de la cellule tant les mécanismes impliqués dans la migration.

Méthodes basées sur la microscopie pour l’évaluation de la Migration de cellules épithéliales lors In Vitro la cicatrisation des plaies

Nous présentons ici un protocole visant à évaluer l’effet des peptides sur la migration des cellules épithéliales bronchiques. Cette méthode permet l’obtention rapide et hautement reproductible des données quantitatives sur la vitesse de fermeture de migrations et de la blessure cellulaire.

Un roman In Vitro de la plaie guérison test afin d’évaluer la Migration cellulaire

Le protocole actuel décrit une méthode intégrée sur le cancer cell migration et invasion sur une seule plateforme en temps réel, offrant une option facilement reproductible et plus économes en temps d’étudier la morphologie et la mobilité de la cellule.

Un Workflow Simple Migration/Invasion à l’aide d’un imageur automatisé de cellules vivantes

Ici, nous présentons un protocole pour un test de rayure in vitro utilisant les fibroblastes primaires et pour un test de guérison in vivo de blessure de peau chez les souris. Les deux essais sont des méthodes simples pour évaluer la cicatrisation in vitro et in vivo des plaies.

Scratch Migration Assay et Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing Scratch Migration

Dans cet article, un insert nouvellement conçu imprimé en 3D est présenté comme un modèle de co-culture et validé par l’étude de la communication intercellulaire paracrine entre les cellules endothéliales et les kératinocytes.

Un insert innovant imprimé en 3D conçu pour permettre des cultures cellulaires 2D et 3D simples

Grâce à l’intégration de la conception de l’expérience d’interaction et de l’analyse des exigences de l’utilisateur, nous introduisons un grattoir cellulaire innovant qui améliore les tests de cicatrisation cellulaire en termes de reproductibilité, de fiabilité, de praticité, d’intégrité cellulaire et d’expérience utilisateur.

Un outil permettant de créer automatiquement des espaces acellulaires stables et reproductibles afin d’améliorer la fiabilité du dosage de la cicatrisation cellulaire

Un protocole pour l’évaluation quantitative de la migration cellulaire 3D à l’intérieur et dans l’interface des hydrogels granulaires est présenté ici.

Quantification de la migration cellulaire tridimensionnelle à l’intérieur et dans les biomatériaux d’hydrogel granulaire

Apprenez à quantifier la migration cellulaire avec un dispositif mécanique à huit canaux dans une plaque 96 puits. Cette méthode semi-haut débit permet d'évaluer rapidement les effets des traitements sans équipement coûteux.

Un dispositif pour effectuer la migration cellulaire / Wound Healing dans une plaque à 96 puits

Explorer plus de vidéos