Name: In - vivo - Bildgebung von Expression Transgene Gene in einzelnen Retinal Vorläufern in Chimäre Zebrabärblingembryonen Studie Zellnichtautonome Einflüsse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Erfahren Sie die In-vivo-Bildgebung retinaler Vorläuferzellen in Zebrabärbling-Chimären. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellnichtautonomer Signale während der Neurogenese in Echtzeit.

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Diese Arbeit wurde von einem ARC DECRA zu PRJ (DE120101311) und einer Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) Forschungsstipendium LP (PO 1440 / 1-1) unterstützt. Die australische Regenerative Medicine Institute wird gefördert aus Mitteln der Landesregierung von Victoria und der australischen Bundesregierung unterstützt. Wir erkennen an Dr. Jeremy Ng Chi Kei, der hier beschriebenen Experimente durchgeführt , wie in Kei et al. 2016. Wir sind für Bestimmungen transgener Fische von Prof. Higashijima und danken Profs dankbar. Turner und Rupp für die Bereitstellung des pCS2 + Plasmid und Dr. Wilkinson zur Erzeugung von H2B-RFP und H2A-GFP-Konstrukte. Wir danken FishCore den zuständigen Personen (Monash University) für unsere Tiere zu kümmern.

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

das Ausmaß, in dem Verständnis benachbarten Zellen Timing der Expression von entscheidender Zellschicksal bestimmenden Faktoren beeinflussen ist wichtig, wenn embryonale oder induziert multipotenter Stammzellen in eine bestimmte post-mitotischen Zelltyp oder sogar gemusterten Gewebe zu unterscheiden, um effizient anweisen Ziel. Darüber hinaus in den Entwicklungs Zellen des lebenden Tieres , diese molekularen Vorgänge der Prüfung stellt zusätzlich relevante dynamische (zeitliche und räumliche) Informationen über die best...

<html> Die Fähigkeit , wichtige Entwicklungsprozesse in einem in - vivo wirbel sichtbar zu machen , um die Herstellung der Zebrabärbling einen Schlüssel Modell für die Untersuchung normalen und Krankheitszuständen ( beschrieben in 1, 2) beigetragen hat. Insbesondere ist die neurale Netzhaut eine zugängliche Teil des zentralen Nervensystems. Die Netzhaut eignet sich für leicht Studien der Neurogenese führen aufgrund ihrer hoch organisierten, aber relativ einfache Struktur, und seine hochkonservierten Neuron - Typen über Vertebratenarten 3. Dynamik der zellulären Verhaltensweisen wie Proliferation, Zellzyklus Ausgang, asymmetrische Zellteilung, Schicksal Spezifikation, Differenzierung und neuronalen Schaltkreise Bildung kann über den gesamten Prozess von Retinogenese folgen, die in der zentralen Netzhaut des Zebrabärbling von 3 d postfertilization abgeschlossen ist ( dpf) 4, 5,ref &quot;&gt; 6, 7. Darüber hinaus können die funktionalen Anforderungen verschiedener Gene in jeder der oben genannten Stufen gleichzeitig in der Zebrabärbling Retina beurteilt werden, einen Vorteil gegenüber anderen Wirbel Modelle, in denen die Bereitstellung Phänotypen aus der Anwendung der Gen-Knockout-Techniken, kann sie nur auf Obduktion bewertet werden von Geweben fixiert. Insbesondere die Verwendung von transgenen Linien in dem wir die Expression von fluoreszierenden Proteinen als Reporter Transgenen in der Netzhaut zu visualisieren und zu überwachen, ermöglicht es uns, die zeitliche Auflösung der Genexpression zu erhalten, die die Entstehung eines bestimmten neuronalen Zelltyp zu Grunde liegt. Aufgrund der schnellen Entwicklung von Zebrabärbling können diese Ereignisse während der gesamten Entwicklungszeit visualisiert werden, wodurch tiefere Einblicke in die zeitliche Bedeutung der Genexpression Verhalten in Bezug auf neuronale Zellidentitätserfassung und Zellenbereitstellt. Schließlich können diese Ansätze wirksam mit der Erzeugung von Chimären über Transplantationen in der Zebrabärbling kombiniert werden, was zu Einsichten in zwei wesentliche Aspekte der Genfunktion. Erstens Zellen transplantiert von einem Spender Embryo untersuchen, in denen ein bestimmtes Gen wurde umgeworfen, während sie in einem unbeschrifteten Wildtyp-Umgebung zu entwickeln, ermöglicht es uns, relevante Informationen über die Genfunktion in einem zellautonome Weise zu erhalten. Dies führt zu wichtigen Erkenntnissen über die Funktion der retinalen Schicksal bestimmenden Faktoren in den Vorläuferzellen sie in der Regel ausgedrückt in. Dies wird durch die Prüfung des Entwicklungsschicksal Ergebnis von Vorläufern exemplifiziert , die nicht mehr funktionsfähiges Protein aus diesen Genen erzeugen können 4, 6, 8, 9. Unter Verwendung dieses Ansatzes haben wir gezeigt , dass viele Schicksal bestimmenden Faktoren (zB Vsx1, Atoh7, PTF1A, Barhl2) handeln Zelle-autonomously spezifische Retina-Nerven Schicksale zu treiben; der Mangel der Genexpression führt in erster Linie zu einem Schicksal Schalter, so dass die Zellen mit Gen lebensfähig bleiben , durch Knockdown eine alternative Zellschicksal 4, 6, 7, 10 übernehmen. Zweitens kann eine solche Chimären-Experimente verwendet werden, um zu beurteilen, wie Wildtyp-Vorläufern verhalten, wenn sie in verschiedenen genetischen Umgebungen zu entwickeln. Zum Beispiel durch die Entwicklung von WT - Zellen zu vergleichen , die in der Regel ein Gen von Interesse (und Reporter - Transgen) in einem WT gegen manipulierte Host - Umgebung (zB Gen - Knockout / Knockdown), die daraus resultierenden Auswirkungen auf die Genexpression und Zellschicksal zum Ausdruck bringen kann beurteilt werden . Der Mangel an bestimmten Neuronentypen in der Host-Umgebung, zum Beispiel, sie Wildtyp-Vorläuferverhalten nicht autonom in einer Zelle Art und Weise ist, um Bias gezeigt zu beeinflussen Richtung in das unterrepräsentierte o Differenzierungsr fehlt neuron Typen 4, 7, 11, 12. Da die Netzhautneuronen in einer konservierten histogenic Reihenfolge durch die sequentiell zeitlich Expression spezifischer neuronaler Schicksal Determinante Gene (Schicksal Genexpression) ( beschrieben in 13) geboren, haben wir diese Methoden zu zeigen , wie der Zeitpunkt des Ausdrucks Schicksal Gen in Wildtyp - Vorläufern betroffen ist, wenn eine solche Vorläufern in Retina-Host-Umgebungen mit induzierten anomale Zellzusammensetzungen zu entwickeln. Hier erläutern wir diese Ansätze als Beweis dafür , wie die Kombination aus relativ Standard und weit verbreitete Techniken , um die Prüfung des Timing des Schicksals Genexpression ermöglicht retinalen Vorläufern 8 in der Entwicklung, 9. Dieses Protokoll beschreibt einen experimentellen Ansatz, Zeitraffer-Bildgebung mit der Leichtigkeit proBildung Transplantation in der ex vivo Entwicklung Zebrafischembryo einzelne mosaik markierten Zellen während der gesamten Dauer der Entwicklungs Retinogenese zu folgen. Durch das Durchführen funktioneller Genmanipulationen entweder im Wirtsembryo, Spenderembryo, beide oder keines von beiden, kann man die Zelle Autonomie der Genfunktion bewerten. Dieser Ansatz kann in jedem anderen System weitgehend auf ähnliche Forschungsfragen angepasst werden, für die die einzelnen Komponenten hier skizzierten geeignet sind.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td>Mit Agarose überzogene Gerichte können einige Tage vorher zubereitet, gegen Austrocknen mit Parafilm versiegelt und bei 4 &#176 gelagert werden; C</td></tr><tr><td>Agarose Low Melt</td><td>Sigma</td><td>A9414-100G</td><td>Kann in größeren Mengen hergestellt, zur Verflüssigung in der Mikrowelle erhitzt und dann in einem 40 &#176 geschmolzen gehalten werden; C Wasserbad. Es können 1 ml Aliquots hergestellt werden (eines für jede Gruppe der eingesogenen Embryonen).</td></tr><tr><td>Borosilliat-Glaskapillarrohr ohne Filament</td><td>SDR Scientfic</td><td>30-0035</td><td>Alternativen mit ähnlichem Durchmesser können verwendet werden&nbsp;</td></tr><tr><td>Borosilliat-Glaskapillarrohr mit Filament</td><td>SDR Scientfic</td><td>30-0038</td><td>Alternativen mit ähnlichem Durchmesser können verwendet werden&nbsp;</td></tr><tr><td>Petrischalen aus Glas (60 mm Durchmesser)</td><td>Science Supply</td><td>1070506</td><td>jede Glasalternative jeder Größe</td></tr><tr><td>Injektionsschlauch (2 m)</td><td>Eppendorf</td><td>524616004</td><td>Dieser verbindet den Nadelhalter mit der Spritze während der Transplantation</td></tr><tr><td>Mikrospritzgussform (Kunststoffform mit keilförmigen Vorsprüngen)</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>PT-1</td><td>Alternativen mit ähnlicher Form können verwendet werden</td></tr><tr><td>Mikronadel Halter</td><td>Narishige</td><td>M-152</td> jede <td>Alternative, die zum Außendurchmesser der Injektionsnadeln passt, kann verwendet werden</td></tr>: <tr><td>Mikroinjektor</td><td>Narishige oder Eppendorf Femtojet</td><td></td><td>Pneumatischer Injektor mit Gasdruck-Mikromanipulator</td></tr><tr><td></td><td>Coherent Scientific</td><td>M330IR</td>, <td>ähnliche Alternativen können verwendet werden</td></tr><tr><td>Mikroladerspitze</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma</td><td>M5904-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Nadelabzieher</td><td>Sutter Instruments</td><td>Modell P-2000</td><td>Die für diesen Abzieher verwendeten Einstellungen sind: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Jeder Nadelabzieher kann verwendet werden, wenn er ein entsprechendes Spitzenmaß ergibt</td></tr>, <tr><td>Parafilm</td><td>Interpath</td><td>PM996</td>, <td>jeder Paraffinfilm</td></tr><tr><td>, Pasteurpipette, Kunststoff</td>, <td>Samco Scientific</td><td>202</td><td></td></tr>, <tr><td>Pasteurpipettenglas</td>, <td>Hirschmann Laborgeräte,</td><td>9260101</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>P5942-25MG</td><td>&nbsp; Protease Typ XIV</td></tr><tr><td>N-Phenylthioharnstoff</td><td>Sigma</td><td>P7629-25G</td><td>PTU ist giftig und kann als Stammlösung hergestellt werden, um einen häufigen Kontakt mit dem Pulver zu vermeiden, konsultieren Sie das Sicherheitsdatenblatt vor dem Kauf/Gebrauch.</td></tr><tr><td>Qiaquick Gelextraktion</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>alle Alternativen zur Aufreinigung von DNA können verwendet werden</td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>alle Alternativen zur Aufreinigung von RNA können verwendet werden</td></tr><tr><td>SP6 mMessage Kit</td><td>Qiagen</td><td>AM1340</td><td>alle Alternativen zur Transkription von DNA mit SP6</td></tr></tbody></table>

in - vivo - bildgebung von expression transgene gene in einzelnen retinal vorläufern in chimäre zebrabärblingembryonen studie zellnichtautonome einflüsse

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Die genetischen und technischen Stärken haben die Zebrabärbling wirbel ein wichtiger Modellorganismus , in dem die Folgen von Gen - Manipulationen vorgenommen können während des schnellen Entwicklungszeit in vivo verfolgt werden. Mehrere Prozesse können einschließlich der Zellproliferation, der Genexpression, Zellmigration und Morphogenese untersucht werden. Wichtig ist, kann die Erzeugung von Chimären durch Transplantationen leicht durchgeführt werden, mosaic Kennzeichnung und Verfolgung einzelner Zellen unter dem Einfluß der Host-Umgebung ermöglicht. Zum Beispiel durch funktionelle Genmanipulationen des Wirtsembryo Kombination (zB durch Morpholino Mikroinjektions) und die Live - Darstellung, die Auswirkungen von extrinsischen, Zelle nichtautonomen Signale (von der gentechnisch veränderten Umgebung zur Verfügung gestellt) auf einzelnen transplantierten Spenderzellen beurteilt werden. Hier zeigen wir, wie dieser Ansatz verwendet wird, das Auftreten von fluoreszierenden Transgen-Expression als Proxy für den Zeitpunkt des Zellschicksals determin zu vergleichenation in verschiedenen genetischen Host-Umgebungen. In diesem Artikel stellen wir das Protokoll für Mikroinjizierung Genaktivität Spenderzellen zu markieren und Knock-Down in Wirts Embryonen zu verursachen, eine Beschreibung des Transplantationstechnik verwendeten chimären Embryonen zu erzeugen, und das Protokoll für die Vorbereitung und in - vivo - Zeitraffer-konfokale läuft Bildgebungs mehrerer Embryonen. Insbesondere Multipositions-Bildverarbeitung ist entscheidend, wenn Timing von Ereignissen wie dem Ausbruch der Genexpression zu vergleichen. Dies erfordert die Datenerfassung von mehreren Kontroll- und Versuchs Embryonen gleichzeitig verarbeitet. Ein solcher Ansatz leicht für Studien der extrinsische Einflüsse in jedem Organ oder Gewebe der Wahl erweitert werden kann, zugänglich Bildgebung zu leben, vorausgesetzt, dass Transplantationen leicht nach etablierten embryonalen Schicksal Karten ausgerichtet werden können.

Diese Arbeit stellt eine experimentelle Protokoll Veränderungen in der Genexpression Timing zu beurteilen, wenn Wildtyp-Retina-Vorläufern in einem morphant Wirtsembryo entwickeln. Die experimentellen Host Embryonen sind PTF1A morphants, die die Zwischen geboren horizontal und amacrine lnterneurone der Retina 7, 26 fehlen. Diese wurden verglichen Wirtsembryos zu steuern, die mit einer Standard-Steuer morpholino injiziert. <p c...

Live Verfolgung einzelner WT retinalen Progenitoren in verschiedenen genetischen Hintergründen ermöglicht die Bewertung des Beitrags der Zelle nicht autonomen Signalisierung während der Neurogenese. Hier wird eine Kombination von Knock-Down, Chimäre Generation über Embryo - Transplantation und in - vivo - Zeitraffer-konfokale Abbildung wurde für diesen Zweck verwendet.

In - vivo - Bildgebung von Expression Transgene Gene in einzelnen Retinal Vorläufern in Chimäre Zebrabärblingembryonen Studie Zellnichtautonome Einflüsse

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren besteht darin zu untersuchen, wie Veränderungen der Genexpression – entweder innerhalb sich entwickelnder Zellen oder in deren umgebendem Milieu – zeitliche Prozesse während der Entwicklung beeinflussen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zu beantworten, beispielsweise ob die zeitliche Steuerung der Zellspezifikation durch Gene gesteuert wird, die zellautonom innerhalb einer Zelle exprimiert werden, oder zellnicht-autonom in benachbarten Zellen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der Möglichkeit, einzelne Vorläuferzellen in einem lebenden Wirbeltier zu verfolgen, während sich diese in genetisch unterschiedlichen Umgebungen entwickeln.Die Durchführung des Verfahrens übernimmt Stefanie Dudczig, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor. Nach der Vorbereitung von Zebrafischembryonen sowie von Mikroinjektionsnadeln mit Morpholinos oder mRNA gemäß dem Textprotokoll tauchen Sie die Nadelspitze in einen Tropfen Mineralöl in einer Schale. Messen Sie das Injektionsvolumen, indem Sie das Fußpedal betätigen, und stellen Sie den Gasdruck und/oder die Dauer so ein, bis das Injektionsvolumen einem Nanoliter entspricht, gemessen mi

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Zebrafisch-Transplantation ermöglicht die Kombination von Genetik und Embryologie an gewebespezifischen Chimären zu erzeugen. Dieses Video zeigt Gastrula inszeniert zelltransplantationen, dass es unserem Labor auf den Rollen von astroglialen Bevölkerung und spezifische Anleitungen Cues während Kommissur Bildung im Vorderhirn zu untersuchen.

Tissue Gezielte Embryonale Chimären: Zebrafisch Gastrula Cell Transplantation

Dieses Protokoll beschreibt Abbildung von einzelnen Neuronen oder Neuralleistenzellen in lebenden Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode wird verwendet, um zelluläre Verhaltensweisen und Aktin-Lokalisierung mittels Fluoreszenz konfokalen Zeitraffer-Mikroskopie zu untersuchen.

Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

Wir zeigen, ein Protokoll zu chimären Zebrafischembryonen für Live-Imaging-zelluläres Verhalten während der Embryogenese zu generieren.

Die Transplantation von GFP-exprimierenden Blastomeren für Live Imaging von Retinal und Entwicklung des Gehirns in Chimäre Zebrafischembryonen

In diesem Video werden Techniken für multicolor konfokalen Zeitraffer-Imaging-und Zielzelle Ablation zur Verfügung gestellt. Zeitraffer-Imaging wird verwendet, um das Verhalten der verschiedenen Zelltypen des Interesses zu...

Multicolor Zeitraffer-Imaging transgener Zebrafische: Visualisierung von Retinal Stammzellen durch gezielte Nervenzellen Ablation Activated

Die vorliegende Video zeigt eine Methode, die nutzt die Kombination von Elektroporation und konfokale Mikroskopie, um Live-Aufnahmen zu den einzelnen neuronalen Vorläuferzellen im sich entwickelnden Zebrafisch Vorderhirn führen.

Zeitraffer-Live-Imaging von klonal verbundenen neuronalen Vorläuferzellen in der Entwicklung von Zebrafisch Vorderhirnneuronen

Eine Methode, bedingt Knockdown ein Zielprotein Ausdruck in der erwachsenen Zebrafisch Retina beschrieben, das geht intravitreal Injektion antisense Morpholinos und Elektroporation sie in der Netzhaut. Das resultierende Protein ist für mehrere Tage, die Prüfung des Proteins Rolle bei der Regeneration oder intakten Netzhaut ermöglicht klopfte.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in die Adult Zebrafisch Retina

Die Abbildung des dynamischen Verhaltens von Organellen und anderen subzellulären Strukturen in vivo kann Aufschluss über ihre Funktion unter physiologischen und Krankheitsbedingungen geben. Hier stellen wir Methoden vor, mit denen zwei Organellen, Zentrosomen und Mitochondrien, genetisch markiert und ihre Dynamik in lebenden Zebrafischembryonen mittels Weitfeld- und Konfokalmikroskopie abgebildet werden können.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

Durch die Kombination von Zelltransplantation, Zytoskelettmarkierung und Funktionsverlust/-gewinn beschreibt dieses Protokoll, wie die migrierende Zebrafisch-prospektive prächordale Platte verwendet werden kann, um die Funktion eines Kandidatengens bei der in vivo-Zellmigration zu analysieren.

Analyzing<em&gt; In Vivo</em&gt; Zellmigration unter Verwendung von Zelltransplantationen und Zeitraffer-Imaging in Zebrafischembryonen

Zebrabärbling retinale Regeneration hat meist unter Verwendung von Festnetzhäuten untersucht. Allerdings dynamische Prozesse wie interkinetic Kern Migration treten während der regenerativen Reaktion und erfordern Live-Cell-Imaging die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen. Hier beschreiben wir Kultur und Abbildungsbedingungen Interkinetic Kern Migration (INM) in Echtzeit unter Verwendung von Multiphotonen-Mikroskopie zu überwachen.

Kultur von Adult transgener Zebrafische Retinal Explantate für das Live-Cell-Imaging von Multiphotonen-Mikroskopie

Imaging netzhautgewebe kann einzellige Informationen liefern, die von den traditionellen biochemischen Methoden gesammelt werden kann nicht. Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung der Netzhaut Scheiben von Zebrafisch für die konfokale Bildgebung. Fluoreszierende genetisch codierten Sensoren oder indikatorfarbstoffen erlaubt Visualisierung von zahlreichen biologischen Prozessen in verschiedenen retinalen Zelltypen.

Zubereitung frische retinalen Scheiben von Erwachsenen Zebrafisch für Ex Vivo Imaging-Experimente

Erfahren Sie die In-vivo-Bildgebung retinaler Vorläuferzellen in Zebrabärbling-Chimären. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellnichtautonomer Signale während der Neurogenese in Echtzeit.

In - vivo - Bildgebung von Expression Transgene Gene in einzelnen Retinal Vorläufern in Chimäre Zebrabärblingembryonen Studie Zellnichtautonome Einflüsse (Video) | JoVE Journal

In - vivo - Bildgebung von Expression Transgene Gene in einzelnen Retinal Vorläufern in Chimäre Zebrabärblingembryonen Studie Zellnichtautonome Einflüsse

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