Macaques Karaciğer ve Mezenterik lenf nodu Seri Koleksiyonu için Laparoskopik Tekniği

Bu minimal invaziv laparoskopik prosedürün genel amacı, hayvan refahını artırırken, farklı zaman noktalarında mezenterik lenf düğümleri ve karaciğer biyopsileri toplayarak GI kanaldan mikrobiyal translokasyonun etkilerinin değerlendirilmesini geliştirmektir. Bu yöntem, HIV biyolojisi alanında enfeksiyonun ve mikrobiyal translokasyonun mezenterik lenf düğümleri ve karaciğer üzerindeki immünolojik sonuçları ile bu dokuların patolojisi hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hayvana veya değerlendirilen parametrelere minimum etkiyle, bir çalışma kapsamında birden fazla zaman noktasında örnekleme yapılmasına olanak tanımasıdır.

Bu yöntem, HIV'ye dair anlayışımızı geliştirmek için kritik öneme sahip örnekler sağlayabilir. Ayrıca, GI inflamasyonunun ve mikrobiyal translokasyonun önemli olduğu diğer modellerde de uygulanabilir. Prosedürü, Washington National Primate Research Center'da veteriner cerrahlar olan Dr. Jeremy Smedley ve Dr. Cassie Moats gerçekleştirecektir.

Metin protokolünde belirtildiği gibi bir makak cerrahiye hazırlandıktan sonra, hayvan steril pencereli bir örtüyle örtülür. Ardından, steril bir kamera örtüsü kullanılarak dijital kamera sıkıca örtülür ve kuleye bağlanır. Rijit skop, kamera başlığı ile birleştirilir.

Ardından, steril bir ışık kablosunu rijit skopa takın ve ışık kaynağına bağlayın. Son olarak, insüflatöre steril bir insüflasyon tüpü monte edin. Laparoskopiye başlamak için, 15 numaralı bir bistüri ucunu göbeğin yaklaşık bir ila iki santimetre soluna yerleştirin ve ciltte karın kaslarına kadar ulaşan yaklaşık 5 milimetrelik bir stab insizyon yapın.

Baskın olmayan el ile, kesinin kranial tarafındaki karın duvarını yukarı kaldırın. Ardından diğer eli kullanarak, hayvanın başına doğru açılan bir varus iğnesinin ucunu insizyondan içeri yerleştirin. Varus iğnesini gövdesinden tutun ve karın duvarından tık sesiyle geçene ve karın boşluğunda iğneye karşı hissedilen direnç azalana kadar sıkıca itin.

Ardından, CO2 insüflatörünün tüpünü iğneye takın ve gazın abdominal kaviteye salınması için musluğu açın. 10 ila 12 mmHg basınca ulaşarak pnömoperitonyum oluşturun. Karın tamamen insüfle edildikten sonra, 15 neşter ucunu sol kranial abdomenin üzerine, son kaburganın yaklaşık iki ila dört cm caudal bölgesine yerleştirin ve yaklaşık beş ila yedi mm'lik bir cilt insizyonu yapın.

Ardından, kesi yerinden beş milimetrelik bir trokar kanül düzeneği yerleştirin. Düzenek, yaklaşık 45 ila 60 derecelik bir açıyla kaudomedial yönde, bir ila iki santimetre derinliğe kadar ilerletilmelidir. Daha sonra, kanülü karın duvarına vidalamak için döndürme hareketiyle 1,5 ila üç santimetre derinliğe ulaşana kadar ileriye doğru kaydırın.

Ardından, trokarı çıkarın. İnsuflatör tüpünü varus iğnesinden ayırın ve sonrasında musluğu kapatın. Pnömoperitonyumu sürdürmek için tüpü kanüle bağlayın ve musluğu açın.

Basıncın başarıyla korunduğu doğrulandıktan sonra, varus iğnesini çıkarın. Ardından, kanül aracılığıyla rijit skopu abdominal kaviteye yerleştirin. Kamera kontrolü altında, varus iğnesinin çıkarılmasından sonra kalan cilt insizyonunu derinleştirerek abdominal kasları ve peritonyumu kesin.

Son olarak, hayvanı ayakları başın yaklaşık 15 ila 30 derece üzerinde olacak şekilde konumlandırın. Mezenterik lenf düğümünden biyopsi almak için, hazırlanan insizyondan karın boşluğuna katı bir prob yerleştirin. Probu omentum ile bağırsak arasına yerleştirin ve nazik, süpürme benzeri bir hareketle bağırsağı omentumdan ayırarak altta gizli kalan mezenteri görünür hale getirin.

Omentumu operasyon alanından uzaklaştırmak için probu kaudalden kranial yöne doğru hareket ettirmeye devam edin. Ardından, probu kullanarak descendants kolonu karın duvarına doğru çekin. Kolon ve mezenterik damarlar boyunca yer alan mezenterik lenf düğümlerini belirlemek için mezenteri prob ile inceleyin.

Lenf nodu belirlendikten sonra, karın boşluğundaki probu Maryland dişli forseps ile değiştirin ve nodun bitişiğindeki mezenteriyi kavrayın. Mezenteriyi insizyona doğru çekin ve skobu kanülden çıkarın. Ardından insufflatörü kapatın ve karındaki gazın boşalmasını sağlayarak mezenterinin dışarı çıkarılmasını kolaylaştırmak için kanül musluğunu açık bırakın.

Ardından mezenteri insizyon boyunca dışarı çekin. İnsizyondan erişimi sağlamak için eksteriorize edilmiş mezenteri pensle tutun. Daha sert bir nodül veya daha gri bir alan olarak görünmesi gereken lenf düğümünü belirlemek için mezenteri palpe edin veya gözlemleyin.

Ardından, kavisli hemostatlar kullanarak lenf nodunun bitişiğindeki mezenterde üç ila beş milimetrelik bir açıklık oluşturun ve dokuya olan tüm bağlantıları künt diseksiyonla ayırın. Gerekirse, damarları 4-0 emilmeyen monofilaman sütür ile bağlayın ve bistüri kullanarak lenf nodunu diseke edin. Daha sonra, biyopsiyi buz üzerinde RPMI 1640 besiyerine yerleştirin.

Son olarak, mezenteri serbest bırakın ve dokuyu karın boşluğuna geri çekebilmek için abdomeni bir kez daha insüfle edin. Masayı yatay konuma getirin. Karaciğer biyopsisi almak için, lenf düğümü alımı için kullanılan insizyon aracılığıyla karın boşluğuna dişli bir kanül yerleştirin.

Ardından kanülü kullanarak, karaciğeri görüntülemek için rijit skopu kranial abdominal kaviteye doğru kaydırın. Kamera kontrolü altında, abdominal kaviteyi şişirmek için daha önce kullanılan kanül aracılığıyla biyopsi pensini yerleştirin. Pensleri, çeneleri dokuya bakacak şekilde belirlenen karaciğer lob marjinin altına konumlandırın ve marjinin çenelerin arasına düşmesini sağlayarak pensleri açın.

Konumlarını ayarladıktan sonra, penseti kapatın ve basıncı yaklaşık 20 ila 30 saniye boyunca koruyun. Ardından, penseti kanül boyunca nazikçe çekerek örneği çıkarın. Biyopsiyi buz üzerinde RPMI besiyerine yerleştirin.

Son olarak, biyopsi bölgesinde kanama olmadığından emin olun ve insizyonları kapatın. Burada, iki sağlıklı dişi makaktan iki farklı zaman noktasında alınan mezenterik lenf düğümü ve karaciğer biyopsilerinden elde edilen hücresel verimler sunulmuştur. Beklendiği üzere, lenf düğümü biyopsileri, karaciğer biyopsileriyle karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha yüksek sayıda izole hücre sağlamıştır.

Kaynak dokuya bakılmaksızın, izole edilen hücrelerin %85'inden fazlası canlıydı. Ardından, izole hücre örnekleri CD45+ lökosit ve CD45+CD3+ lenfosit popülasyonları açısından analiz edildi. Mezenterik lenf düğümleri, karaciğer kaynaklı hücrelerle karşılaştırıldığında daha yüksek CD45+ lökosit ve CD3+ lenfosit frekanslarına sahipti.

İzole edilen popülasyonların ayrıntılı karakterizasyonu, mezenterik lenf düğümlerinin anlamlı derecede daha yüksek oranlarda CD3+T hücreleri ve CD4+T hücrelerinin yanı sıra artmış sayıda CD8+T hücreleri içerdiğini göstermiştir. Buna karşılık, karaciğer anlamlı derecede CD14+lökositler açısından zenginleşmiştir. Her iki organ da benzer miktarlarda CD20+B hücreleri sergilemiştir.

Bu teknikte uzmanlaşıldıktan sonra işlem 30 ila 40 dakikada tamamlanabilir. Hayvanlar genellikle birkaç saat içinde anesteziden çıkar, aktif hale gelir ve yemek yemeye başlar; ayrıca insizyonlar o kadar küçüktür ki kafes başında görülmeleri zor olabilir. Bu prosedür uygulanırken, hayvanların başarısını kolaylaştıracak bir vücut kondisyonunda tutulmaları önemlidir.

Belirgin mezenterik yağ, lenf nodlarını gizlediği, doku kırılganlığını ve kanamayı artırdığı için zorlu bir engel teşkil edebilir. Bu prosedürün ardından; sistemik ve mukozal immün yanıtları, mikrop durumunu ve epitel bariyerleri ile viral yükleri değerlendirmek amacıyla flebotomi, periferik lenf nodu biyopsisi, üst ve alt Gİ endoskopisi ve rektal biyopsi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, laboratuvarımızdaki araştırmacıların, daha önce yalnızca nekropsi ile erişilebilen makak dokularındaki mikrobiyal popülasyonları inflamasyon sürecinde boylamsal olarak incelemelerine olanak sağlamıştır.

Mikrobiyal translokasyon, HIV patogenezini tetikleyen inflamasyonun temel nedenlerinden biri olduğundan, bu tekniğin etkileri HIV tedavisine kadar uzanmaktadır. Bunun seri bir şekilde değerlendirilmesi, potansiyel hedeflerin belirlenmesini sağlayabilir ve terapötik müdahalelerin değerlendirilmesine olanak tanıyabilir. Herhangi bir virüsle enfekte olmuş makaklarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Macaquesin herpesvirus 1 dahil olmak üzere biyotehlikeler için uygun eğitim, uygun kişisel koruyucu donanım, ısırma ve tırmalama kitleri ve uygun tıbbi takip gibi önlemler mevcut olmalıdır.