Gemischte Primärkulturen von Murine Duenndarm bestimmt zur Untersuchung von Gut Hormonausschüttung und Live Cell Imaging von enteroendokrinen Zellen

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, gemischte murine Darmzellen zu isolieren und zu kultivieren, um die Untersuchung der Peptidsekretion im Darm und die Bildgebung lebender Zellen von enteroendokrinen Zellen zu ermöglichen. Wir haben diese Methode ursprünglich entwickelt, um die in vitro Charakterisierung von enteroendokrinen Zellen zu ermöglichen. Enteroendokrine Zellen überwachen den Darminhalt und regulieren die Homöostase des Körpers.

Aber sie waren schwer zu untersuchen, da sie über das gesamte Darmepithel verstreut sind. Die hier beschriebenen Calcis sind besonders nützlich, wenn sie mit der genetischen Fluoreszenzmarkierung von enteroendokrinen Zellen kombiniert werden, da dies den Einsatz von elektrophysiologischen Einzelzell- und Lebendzell-Bildgebungsverfahren ermöglicht. Das Verfahren wird von Cheryl Brighton, einer Post-OP in unserem Labor, demonstriert.

Übertragen Sie zunächst einen isolierten Zwölffingerdarm der Maus in eine 10 Zentimeter große Petrischale, die mit PBS gefüllt ist. Fassen Sie mit einer Pinzette vorsichtig ein Ende des Darmfragments und führen Sie die Spitze einer Pasteurpipette in das Lumen ein. Spülen Sie dann den Darminhalt mit gekühltem PBS aus.

Wiederholen Sie dies für beide Darmenden, bis der Großteil des Inhalts entfernt ist. Übertragen Sie den gespülten Darm in eine saubere Petrischale, die mit frisch gekühltem PBS gefüllt ist. Entfernen Sie unter einem Präpariermikroskop das Fettgewebe und das Mesentär aus dem Darmfragment und verhindern Sie, dass sich die Muskelschicht abreißt.

Identifizieren Sie als Nächstes einen Lappen der Muskelschicht am proximalen Ende des Gewebes. Ziehen Sie dann mit zwei Sätzen feinen Forceps vorsichtig eine kleine Menge der Schicht rund um den Darm ab. Fassen Sie den Darm und so viel Muskellappen wie möglich, ziehen Sie dann die Schichten vorsichtig auseinander und beginnen Sie, die Muskelschicht um den Darm herum abzuziehen.

Halten Sie die Pinzette dicht beieinander, um ein Reißen der Muskelschicht und des Epithels zu verhindern. Entfernen Sie die Muskelschicht von der gesamten Länge des Darmfragments. Öffnen Sie anschließend den Darm, indem Sie ihn in Längsrichtung schneiden, und geben Sie ihn in eine saubere Petrischale mit frisch gekühltem PBS.

Rühren Sie das Taschentuch um, um es von restlichem Glockenspiel oder Schleim zu waschen. Nach dem Waschen schneiden Sie das Gewebe mit einer chirurgischen Skalpellklinge ab, um Quadrate von etwa ein bis zwei Quadratmillimetern zu erhalten. Anschließend werden die erhaltenen Fragmente mit einer vorbenetzten Pasteurpipette mit einer vorgeschnittenen Spitze in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt, das mit etwa 20 Millilitern gekühltem PBS gefüllt ist.

Schütteln Sie den Schlauch vorsichtig, um die Gewebefragmente zusätzlich zu waschen, und lassen Sie das Gewebe sedimentieren. Sobald sich das Gewebe abgesetzt hat, aspirieren Sie den größten Teil des PBS und waschen Sie die Probe noch einmal mit frischem PBS. Um den Darm zu verdauen, verwenden Sie eine serologische 10-Milliliter-Pipette, um die Gewebefragmente in ein steriles 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu übertragen, das gekühltes steriles DMEM enthält, schwenken Sie die Suspension, lassen Sie das Gewebe sich absetzen und entfernen Sie dann das Medium.

Geben Sie 7 Milliliter des Verdauungsmediums zu den Gewebefragmenten und schwenken Sie die Suspension. Inkubieren Sie die Suspension fünf Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation schütteln Sie das Röhrchen vorsichtig für etwa drei Sekunden.

Sedimentieren Sie das unverdaute Gewebe und geben Sie das Verdauungsmedium in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Lassen Sie versehentlich gesammeltes Gewebe sich absetzen und übertragen Sie es mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette zurück in das 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das das unverdaute Gewebe enthält. Bewahren Sie ein kleines Volumen des Aufschlussmediums für die mikroskopische Betrachtung auf und entsorgen Sie die Reste.

Überwachen Sie den Inhalt des Aufschlussmediums unter dem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass die Suspension nicht viele Krypten enthält. Fügen Sie anschließend 7 Milliliter frisches Verdauungsmedium hinzu und führen Sie den Aufschlussvorgang noch einmal durch. Zur Herstellung der Kryptenfragmentsuspension fügen Sie den Darmfragmenten 7 Milliliter frisches Verdauungsmedium hinzu.

Inkubieren Sie das Gewebe in einem Wasser bei 37 Grad Celsius für zehn Minuten. Schütteln Sie die Probe länger und kräftiger, diesmal alle fünf Minuten. Sedimentieren Sie das unverdaute Gewebe und geben Sie das Verdauungsmedium in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Lassen Sie versehentlich gesammeltes Gewebe sich absetzen und übertragen Sie es mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette zurück in das 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das das unverdaute Gewebe enthält. Geben Sie 7 Milliliter frisches Verdauungsmedium zu den Darmfragmenten und starten Sie den nächsten Aufschluss. Dann zentrifugieren Sie das aus dem vorherigen Aufschluss gewonnene Medium bei 100 x g bei Raumtemperatur für 3 Minuten.

Nach dem Verwerfen des Überstands wird das Zellpellet durch vorsichtiges Pipettieren in 5 Millilitern des vorgewärmten Kulturmediums wieder suspendiert. Legen Sie dann die Probe beiseite und entnehmen Sie ein kleines Aliquot der Zellsuspension. Bestätigen Sie unter dem Lichtmikroskop, dass die Probe isolierte Kryptenfragmente enthält.

Wiederholen Sie die Verdauung des Gewebes weitere 2-3 Mal oder bis der Großteil des Gewebes verdaut ist. Sobald die Aufschlussüberstände aufgefangen wurden, kombinieren Sie alle und zentrifugieren Sie die Probe bei 100x g bei Toom-Temperatur für drei Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet durch vorsichtiges Pipettieren wieder, bis keine Klumpen mehr sichtbar sind, und geben Sie 5 Milliliter vorgewärmtes Kulturmedium mit 10 Mikromolaren Y-27632 zu, um Anoikis zu verhindern.

Zum Schluss filtrieren Sie die Zellsuspension durch einen 100-Mikron-Filter, um unverdautes Gewebe zu entfernen. Waschen Sie den Filter mit weiteren 2 Millilitern des vorgewärmten Nährmediums, das mit Y-27632 versetzt ist. Entfernen Sie vor der Aussaat der Zellen die mit Basalmembranmatrix beschichtete Platte aus dem Inkubator.

Entfernen Sie die überschüssige Basalmembran-Matrixlösung von der Platte und geben Sie 250 Mikroliter des vorgewärmten Kulturmediums, ergänzt mit 10 Mikromolar Y-27632, in jede Vertiefung. 250 Mikroliter der Zellsuspension pro Vertiefung der 24-Well-Platte werden durch tropfenweises Pipettieren in einer langsamen Zickzackbewegung ausgesät. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Vorgestellt werden die Mikroskopaufnahmen der Monoschichten der primären Dünndarmzellen, die nach 18 bis 24 Stunden Kultur aufgenommen wurden. Primäre Dünndarmzellen, die in vitro kultiviert wurden, reagierten auf Reize, die intrazelluläres Kalzium oder zyklisches AMP erhöhten, was zu einer zweifachen Erhöhung der Freisetzung von Glucagon-ähnlichem Peptid-1 führte, wenn die Zellen mit Bombesin behandelt wurden, und zu einer elffachen Sekretionsverstärkung, wenn sie gleichzeitig mit Forskolin und IBMX stimuliert wurden. Schließlich wurde unter Verwendung von Kulturen, die von transgenen Mäusen erzeugt wurden, die GCAMP 3 unter der Kontrolle des Pro-Glucagon-Promotors exprimierten, gezeigt, dass primäre Dünndarm-L-Zellen auf die Stimulation von Bombesin und Kaliumchlorid mit einem Anstieg des zytosolischen Kalziums reagieren, wie die erhöhte Fluoreszenz zeigt.

Das demonstrierte Verfahren konzentriert sich auf die kulturellen Dünndarmzellen, die viele Runden als herausfordernd empfunden haben. Ein ähnliches Practical verwenden wir auch für die Kultivierung anderer Darmsegmente, sowohl murinen als auch menschlichen Ursprungs. Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Kein Präparat gleicht dem anderen, daher ist es wichtig, daran zu denken, die Aliquots jedes Aufschlusses unter dem Mikroskop zu untersuchen. Auf diese Weise können Sie den Fortschritt beurteilen und die Intensität des Schüttelns und die Anzahl der Digests entsprechend anpassen.