성숙한 슈반 세포 생성을위한 골수 유래 선조 세포의 저산소 전처리

이 세포 배양 기술의 전반적인 목표는 골수 신경 전구 세포를 풍부하게 하여 기능적인 슈반 세포로 분화하는 것을 촉진하는 것입니다. 이 방법은 줄기 세포 및 재생 의학의 핵심 문제, 즉 외상 후 축삭 재성장 및 재수초화를 돕기 위해 신경교세포를 생성하기 위해 제한된 신경 전구 세포를 사용하는 방법을 해결합니다. 이 기술의 장점은 자가 세포 치료에 사용하기 위해 골수 기질 세포에서 신경 세포 확장을 촉진하기 위해 효율적인 배양 컨디셔닝을 사용한다는 것입니다.

배양 2일 후, 사용한 배지와 비부착성 세포의 75%를 제거하고 10mm PBS 세척을 3회 실시하여 부착성 세포를 헹굽니다. 세 번째 세척 후 PBS를 10mL의 골수 장루 세포(MSC) 성장 배지로 교체하고 배양액을 인큐베이터로 되돌립니다. 눈에 보이는 군체는 6일에서 7일째까지 나타나야 합니다.

10일째에 신선한 PBS로 배양액을 세척하고 1.5ml의 재조합 효소 세포 해리 시약으로 세포를 분리합니다. 섭씨 37도에서 5분 후 MSC 성장 배지 3ml를 첨가하여 반응을 중화하고 원심분리를 통해 분리된 세포를 수집합니다. 펠릿을 5ml의 새로운 MSC 성장 배지에 재현탁시키고 새로운 10cm 조직 배양 플레이트에서 제곱센티미터당 4배 밀도의 4배로 세포를 시딩합니다.

세포는 통과 후 2일 이내에 80-90% 포화도에 도달해야 합니다. 저산소 전처리의 경우 먼저 링 클램프를 풀고 노출된 부분을 70% 에탄올로 청소합니다. 또한 저산소증 챔버를 구성 요소로 분해하고 층류 후드에 넣어 자외선 아래에서 15분 동안 살균합니다.

다음으로, 방금 시연한 바와 같이 10ml의 PBS로 80-90% confluent MSC 배양액을 세척하고 25millimolar hepes가 보충된 새로운 MSC 성장 배지로 배양액을 처리합니다. 처리된 배양액을 재조립된 저산소증 챔버에 넣고 링 클램프를 조입니다. 챔버의 연결 끝을 밀봉하여 가스 누출이 없는지 확인하고 99%질소와 1%산소의 가스 혼합물을 분당 10리터의 유속으로 챔버로 플러시합니다.

5분 후, 챔버를 세포 배양 인큐베이터에 16시간 동안 넣습니다. 다음날 아침, 방금 설명한 대로 세포를 분리하고 원심분리로 수집합니다. 펠릿을 신경 전구 배지에 재현탁시키고 12일 동안 섭씨 37도 및 5%CO2에서 배양을 위해 부착성이 낮은 6웰 플레이트에 제곱센티미터당 세 번째 세포를 10회 6회 파종합니다.

세포의 상당한 크기의 비부착 구체는 6일에서 7일까지 관찰해야 합니다. 저산소증 조건화 배양에서 더 많은 신경 영역이 정상 목산소 하에있는 배양보다 10 일에서 12 일까지 명백합니다. 12일째에 10ml 피펫을 사용하여 신경구를 15ml 원뿔형 튜브로 옮기고 원심분리를 통해 신경구를 수집합니다.

DMEM/F12에 구체를 재현탁하고 웰당 1.5ml의 신경교세포 유도 배지에 폴리-D-라이신 라미닌 코팅된 6개의 웰 플레이트에 제곱센티미터당 5-10개의 신경구체를 플레이트화합니다. 최소 7일 동안 구 세포 배양을 유지하고 3일마다 배지를 새로 고칩니다. 등뿌리신경절을 채취하기 위해, 첫 번째 배아를 엎드린 자세로 해부 현미경으로 실온 PBS가 들어있는 10cm 배양 접시에 옮기고 척수 양쪽을 따라 미세 해부 겸자를 삽입합니다.

둔기 박리를 사용하여 집게를 사용하여 척수를 주변 연조직과 분리하여 목 구멍과 꼬리 그루터기를 따라 척수를 절제합니다. 척수, 신경근 및 부속된 등쪽 뿌리 신경절만 남을 때까지 해제된 척수에서 잔여 연조직을 제거합니다. 연결된 신경근에서 개별 등쪽 뿌리 신경절을 분리합니다.

그런 다음 1밀리리터 피펫 팁이 장착된 피펫 펜을 사용하여 최대 100개의 등쪽 신경절을 PBS의 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 이동합니다. 원심분리를 통해 신경절을 수집하고 튜브당 200마이크로리터의 재조합 효소 세포 해리 시약에 펠릿을 재현탁합니다. 섭씨 37도에서 10분 후, 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 등뿌리 신경절을 다시 원심분리하여 등뿌리 신경절 뉴런 유지 배지에서 펠릿을 부드럽게 분쇄합니다.

등뿌리 신경절 세포를 5 곱하기 10에서 평방 센티미터당 세 번째 세포로 폴리-D-라이신 라미닌 코팅된 6개의 웰 플레이트에 파종합니다. 섭씨 37도 및 5%CO2에서 2일 동안 배양한 후 세포를 세척하고 신경 세포 배양을 신선한 등쪽 뿌리 신경절 뉴런 정제 배지의 인큐베이터로 다시 2일 동안 반환합니다. 3-4번의 유지 및 정화 주기 후, 배근 신경절 세포 배양은 신경 세포 마커 Tuj-1에 대해 양성 반응을 보이고 신경교세포 마커 S100 beta에 대해 음성 판정을 받아야 합니다.

Schwann cell-like cell culture 7일차에 PBS에서 세포를 헹구고 섭씨 37도의 웰당 0.5ml의 재조합 효소 세포 해리 시약으로 5분 동안 해리합니다. 세포 펠릿을 공동 배양 배지에 재현탁시키고 Schwann 세포와 같은 세포를 정제된 배근 신경절 뉴런 배양액에 1회 10회에서 제곱센티미터당 세 번째 세포로 파종하여 섭씨 37도 및 5%CO2에서 14일 동안 공동 배양합니다.건강한 MSC는 많은 수의 계대 동안 유지되어 왔고 다능성을 잃은 MSC의 사각형 모양과 대조적으로 가늘어지는 형태를 나타냅니다.

확장된 MSC 콜로니는 MSC 마커의 발현, 조혈모세포 마커의 부재, 지방형성, 골형성 및 연골형성 계통으로의 분화 능력을 입증해야 합니다. 저산소 전조건화(hypoxic preconditioning)를 거친 건강한 MSC 배양은 수와 크기 모두에서 더 큰 신경구를 보여줍니다. 등뿌리 신경절 뉴런 네트워크의 순도는 뉴런 마커 Tuj-1의 발현과 슈반 세포 마커 S100의 부재에 의해 확인될 수 있습니다.

등뿌리 신경절 뉴런과 14일 동안 공동 배양한 후, 슈반 세포와 유사한 세포는 성숙한 운명에 전념한 슈반 세포의 특징과 기능적 특성을 획득합니다. 일단 숙달되면, 세포 확장 기술이 적절하게 수행되면 10일 이내에 인간 또는 쥐 BMSC에서 신경 전구 하위 집단을 확장할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 BMSC 샘플에 네스틴 양성 신경전구세포가 부여되어 있고 CD45 양성 조혈전구세포가 모두 제거되었는지 확인하는 것이 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 BMSC를 소싱하고, 신경 전구 하위 집단을 풍부하게 하고, 외상 후 축삭 재성장 및 재수초화를 향상시키는 데 사용하기 위해 신경 전구 분화를 운명에 커밋된 슈반 세포로 지시하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차에 따라 성숙한 슈반 세포와 같은 수초성 신경교세포를 유도하여 말초 및 중추 신경계의 탈수초 손상 및 질병에 대한 치료법 개발에 사용할 수 있습니다.