Mittelmaßnahme Vorbereitung von

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, eine einfache und kostengünstige Methode zur Sammlung von Drosophila-Embryonen im mittleren Maßstab bereitzustellen und Proteinextrakte herzustellen, die in nachgeschalteten proteomischen Anwendungen wie der Affinitätsreinigung gekoppelt mit Massenspektrometrie eingesetzt werden können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Zellsignalgebung und Entwicklungsbiologie zu beantworten.

Beispielsweise, wie spezifische Proteine und Proteinwechselwirkungen die Zellkommunikation während der Entwicklung eines Organismus vermitteln. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine einfache und kostengünstige Methode zur Herstellung einer Drosophila-Embryo-Lysierung darstellt, die für nachgeschaltete Anwendungen wie die Protein-Affinitätsreinigung verwendet werden kann.

Traditionell sammelten Forscher Drosophila-Embryonen in sehr großen Populationskäfigen. Wir stellen jedoch ein benutzerfreundliches Verfahren zur Sammlung von Embryonen in mittelgroßen Käfigen vor, das problemlos in jedem Labor eingerichtet werden kann. Nachdem Fünf-Liter-Behälter vorbereitet und 25 mal 25 Zentimeter große Quadrate aus Nylonnetz gemäß der schriftlichen Anleitung ausgeschnitten wurden, wird das Netz über den Behälter gelegt und mit dem Deckel festgedrückt.

Stellen Sie sicher, dass das Netz straff sitzt und der Deckel nicht schief sitzt. Der Käfig ist nun bereit, mit Fliegen besiedelt zu werden. Nachdem ein Liter-Kunststoffgefäße und 18 mal 18 Zentimeter große Nylonnetzquadrate vorbereitet wurden, legen Sie das Netz über den oberen Rand des Gefäßes und schrauben den Deckel fest, um es zu verschließen.

Stellen Sie sicher, dass das Netz fest sitzt und der Deckel nicht schief steht. Vermehren Sie die transgenen Fliegenlinien, die das gewünschte typisierte Protein tragen. Überführen Sie die Flaschen alle zwei Tage, bis für jede Fliegenlinie 25 bis 30 Flaschen angesammelt sind.

Amplifizieren Sie eine Kontrollstammlösung auf ähnliche Weise. Erwärmen Sie anschließend die Apfelsaftplatten auf Raumtemperatur. Verteilen Sie dann mit einem behandschuhten Finger etwas feuchte Hefe-Paste in der Mitte der Platten.

Ein etwa sechs Zentimeter großer Kreis für eine 15-Zentimeter-Platte und ein vier Zentimeter großer Kreis für eine 10-Zentimeter-Platte werden hergestellt. Nach der Betäubung der Fliegen und deren Übertragung in die vorbereiteten Käfige mit nach unten zeigendem Netz, werden die Käfige mit Apfelsaftplatten abgedeckt.

Lassen Sie die Fliegen aufwachen. Drehen Sie dann die Käfige um und inkubieren Sie die Fliegen zwei bis drei Tage lang bei Raumtemperatur. Wechseln Sie die Platten zweimal täglich, indem Sie den Käfig umgedreht halten und die Platte festhalten, während Sie das Klebeband von der Platte ablösen.

Tippen Sie vorsichtig auf den gesamten Käfig auf der Bank und tauschen Sie die alte Platte schnell gegen eine neue aus, wobei Sie versuchen sollten, das Entweichen der Fliegen zu verhindern. Lassen Sie die Fliegen über Nacht oder für einen anderen gewünschten Zeitraum Embryonen auf frischen Apfelsaftplatten ablegen. Markieren und wiegen Sie am folgenden Morgen die Netzbehälter zur Sammlung der Embryonen.

Einer für jede verwendete Fliegenlinie. Bereiten Sie 1x Lysepuffer in einem 50-Milliliter-Röhrchen mit zuvor hergestellten Reagenzien vor, indem Sie 40 Milliliter Wasser zu 10 Milliliter 5x konzentriertem Lysepuffer in einem 50-Milliliter-Röhrchen hinzufügen. Geben Sie 50 Mikroliter Ein-Molar DTT zur Endkonzentration von einem Millimolar hinzu.

Sorgfältig mischen und die Lösung auf zwei 50-Milliliter-Röhrchen verteilen. Zu einem der Röhrchen eine Proteaseinhibitor-Tablette hinzufügen und das Röhrchen für 30 Minuten bei vier Grad Celsius auf einen Rotator stellen.

Während sich die Tablette auflöst, beginnen Sie mit der Sammlung der Embryonen, indem Sie die Apfelsaftplatten in den Käfigen mit den Genotypen der verwendeten Fliegenlinien kennzeichnen. Tauschen Sie die Platten gegen frische aus und geben Sie ausreichend Wasser hinzu, um jede Apfelsaftplatte zu bedecken.

Danach die Embryonen vorsichtig mit einem weichen Pinsel von der Platte lösen. Die Embryonen in den zuvor gewogenen und markierten Netzbehälter gießen und das überschüssige Wasser ablaufen lassen. Anschließend das Netz kurz auf Papiertüchern antupfen, um restliches Wasser zu entfernen.

Um die Embryonen von der Chorionhülle zu befreien, füllen Sie eine sechs Zentimeter große Petrischale zur Hälfte mit 50 %iger Bleiche. Bereiten Sie anschließend zwei größere Petrischalen mit Wasser vor. Tauchen Sie den Netzbehälter mit den Embryonen für 90 Sekunden in die 50 %ige Bleiche ein.

Tippen Sie während der Inkubation einige Male vorsichtig auf das Netz, um die Embryonen in der Bleichlösung zu suspendieren. Am Ende der Inkubation spülen Sie den Netzbehälter mit Wasser in jeder der beiden Schalen etwa 10 Sekunden lang aus. Anschließend spülen Sie den Netzbehälter, einschließlich der Seiten und der Außenseite, gründlich mit 18,2 Megohm-Zentimeter-Wasser aus einer Sprühflasche ab.

Der Geruch von Bleiche sollte nach einer gründlichen Wäsche nicht mehr wahrnehmbar sein. Das Netzgefäß auf Papierhandtüchern abtupfen. Danach das Netzgefäß mit den Embryonen wiegen und das Gewicht des leeren Gefäßes abziehen.

Notieren Sie das resultierende Gewicht der Embryonen. Um den Embryo-Extrakt vorzubereiten, geben Sie ein Milliliter Lysepuffer mit Proteaseinhibitoren in einen Dounce-Glashomogenisator und stellen Sie ihn auf Eis. Übertragen Sie anschließend die Embryonen aus dem Netzbehälter in den Homogenisator.

Verwenden Sie ein Milliliter Lysepuffer, um die verbleibenden Embryonen vom Sieb abzuwaschen. Geben Sie die Embryonen und den Puffer zu dem Material im Homogenisator. Lassen Sie die Embryonen dann auf den Boden des Homogenisators absinken und aspirieren Sie vorsichtig den Überstand.

Fügen Sie anschließend Lysepuffer mit Proteaseinhibitoren zum Homogenisator hinzu, wobei fünf bis sechs Milliliter Lysepuffer pro Gramm Embryonen angestrebt werden sollen. Danach setzen Sie einen lose sitzenden Stößel ein, um die Embryonen mit vier bis sechs Stößen zu homogenisieren. Bei den ersten Stößen tritt ein größerer Widerstand auf.

Bemühen Sie sich, den Pistill in einer kontinuierlichen Bewegung zu führen, um zu vermeiden, dass die Lösung spritzt. Wechseln Sie dann zu einem passgenauen Pistill und homogenisieren Sie die Embryonen mit acht bis zehn Stößen.

Den Homogenat 20 Minuten auf Eis inkubieren. Anschließend den Homogenat in Mikrozentrifugenröhrchen überführen und bei 13.000 × g und 4 °C 15 Minuten zentrifugieren.

Unter Vermeidung der Pellets in der obersten Lipidschicht werden die Überstände in frische Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis überführt. Nach Wiederholung der Zentrifugation sammeln Sie die Überstände vorsichtig mit einer Ein-Milliliter-Spitze und überführen sie in gekühlte 10-Milliliter-Spritzen, die mit 0,45-Mikrometer-Filtern ausgestattet sind.

Bringen Sie die gesamte Lösung in beschriftete 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Schockgefrieren Sie die Proben in flüssigem Stickstoff und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Alternativ verwenden Sie sie sofort für Proteinreinigungsversuche.

Mithilfe des in diesem Video beschriebenen Protokolls wurden Lysate aus Drosophila-Embryonen hergestellt, die ubiquitär das EGFP-ERK-Protein unter Kontrolle des arm-odillo-Promotors exprimieren. Der Proteinexpression wurde mittels Western Blotting für gesamtes ERK-Protein bestätigt, um gleichzeitig die Mengen des endogenen und des transgenen EGFP-ERK nachzuweisen, die jeweils bei 42 Kilodalton und 69 Kilodalton wandern. In der gelb-weißen Kontrolllinie wurde ein einzelnes Band entsprechend dem nicht markierten endogenen ERK detektiert, was eine erfolgreiche Isolierung von ERK und EGFP-ERK aus den Embryonen bestätigt.

Um zu überprüfen, ob das Extraktionsprotokoll für die nachfolgende Reinigung des markierten Proteins geeignet ist, wurden Extrakte aus den gelb-weißen sowie den arm-EGFP-ERK-Fliegen einer Affinitätsreinigung unterzogen, wobei GFP-Agarose-Kügelchen verwendet wurden. Die Silberfärbung von Proben, die auf einem gradientenförmigen SDS-PAGE aufgetrennt wurden, zeigt eine erfolgreiche Anreicherung des Zielproteins EGFP-ERK. Neben EGFP-ERK enthielt die experimentelle Bande zusätzliche Banden, die in der Kontrollprobe nicht beobachtet wurden, was darauf hindeutet, dass die Reinigung mögliche mit ERK interagierende Proteine mitangereichert hat.

Wenn die Sammlung der Embryonen und die Extraktionsschritte einmal beherrscht sind, können sie in etwa zwei Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die Extraktionsschritte auf Eis durchzuführen und Proteaseinhibitoren zu verwenden, um den Proteinabbau zu minimieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Drosophila-Populationskäfige im mittleren Maßstab einrichtet und Gesamtzellproteinauszüge aus Embryonen herstellt.