通过磁性活化细胞分选分离的血管周围脂肪组织的脂肪细胞祖细胞的扩增和脂肪生成诱导

这些分离和分化方案的总体目标是从血管周围脂肪组织获得脂肪细胞祖细胞，并诱导它们分化为成熟的脂肪细胞。该方法允许分析来自血管周围脂肪组织的特异性和确定的脂肪细胞祖细胞群，对其形态、活力以及增殖和分化潜力的影响最小。该技术的主要优点是，与荧光激活细胞分选相比，它可以增加每克脂肪组织对抗原呈递细胞的分离。

在确认对脚趾捏没有反应后，沿胸骨做一个垂直的中线切口到大鼠的会阴区域，以进入腹腔。暴露肠系膜上动脉、肠系膜小阻力血管和胸主动脉，并切断与肠系膜和主动脉的所有连接。收集性腺脂肪组织，并将分离的脂肪垫转移到补充有 10 毫摩尔堆的 Krebs-Ringer 碳酸氢盐缓冲液或 KRBB 溶液的新容器中。

将容器转移到含有 KRBB 溶液的培养皿中，并将培养皿置于解剖显微镜下。从肠系膜阻力小血管和主动脉中去除血管周围脂肪组织。在生物安全罩中，将约 50 毫克组织转移到含有 1 毫升胶原酶 I 型溶液的 1.7 毫升试管中，然后将组织切碎成 1 至 3 毫米的小块。

重要的是要充分切碎脂肪组织，以使胶原酶彻底渗透到结缔组织中。将片段在 37 摄氏度下振荡孵育 1 小时。然后，通过单独的 100 微米和 40 微米样品池过滤器将消解物依次过滤到 50 毫升的试管中。

通过离心收集所得滤液，并将沉淀重悬于 1 mL 红细胞裂解缓冲液中。将细胞悬液转移到新的 1.7 mL 微量离心管中，在室温下避光孵育 5 分钟。然后用另一次离心收集基质血管组分细胞，并将沉淀重悬于基质血管组分基础培养基中进行计数。

为了通过磁激活细胞分选分离脂肪细胞祖细胞，通过离心收集细胞，并以 1 乘以 10 倍/毫升的浓度将沉淀重悬于磁激活细胞分选封闭缓冲液中，以 6 倍/毫升的浓度在 4 摄氏度下孵育 20 分钟。隔离的所有步骤都必须在 4 摄氏度下进行，而不是在冰上进行。接下来，将细胞与 5 μL FITC 偶联的小鼠抗 CD34 一起孵育 30 分钟。

通过离心收集细胞。然后将细胞与 4 μL 抗 FITC MicroBeads 在 96 μL 磁激活细胞分选缓冲液中，在避光中孵育 5 分钟。孵育细胞时，将多排序柱放入磁力分离器中，柱下放置 5 mL 废液管。

用 500 μL 磁激活细胞分选缓冲液冲洗色谱柱，并丢弃流出物和废液管。然后在柱下放置一根新管，将细胞加载到柱顶部，将未标记的 CD34 阴性细胞收集到新的收集管中。当所有细胞都通过色谱柱顶部时，用 500 μL 脱气磁激活细胞分选缓冲液洗涤色谱柱 3 次，继续在收集管中合并洗脱液。

最后一次洗涤后，将色谱柱转移到新的收集管中，并使用色谱柱柱塞将 1 毫升磁激活细胞分选缓冲液通过色谱柱冲洗到试管中，以收集 CD34 阳性细胞。通过离心收集脂肪细胞祖细胞。然后将 CD34 阳性组分在 10 μL 兔抗血小板衍生生长因子受体 α 中孵育 30 分钟。

孵育结束时，再次离心细胞，并将沉淀物放入 4 μL 抗兔 IgG MicroBeads 和 96 μL 磁激活细胞分选缓冲液中孵育，用于血小板衍生生长因子受体 α 阳性细胞的磁珠分离，如刚才所示。为了培养 CD34 阳性血小板衍生的生长因子受体 α 阳性脂肪细胞祖细胞，将细胞接种在基础培养基中的单个 6 孔组织培养板中，并将板置于 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的细胞培养箱中。3 次连续传代后，将细胞以 1 倍 10 至每孔 2 个细胞的速度接种到黑色 96 孔组织培养板中，并在 8、24、48 和 96 小时以 5 倍 10 至每孔第 4 个细胞的增殖，根据标准增殖测定方案。

为了诱导脂肪生成，当脂肪细胞祖细胞培养物达到汇合时，用脂肪细胞祖细胞基础培养基喂养细胞 48 小时，然后用骨形态发生蛋白 4 处理培养物再 48 小时。第 3 天，用脂肪细胞祖细胞诱导培养基替换培养基，不含 IBMX 和塞米松 14 天。然后可以根据标准脂肪生成测定方案，在 48 孔组织培养板中以 1 乘以 10 至第 4 个细胞/孔评估培养物中的脂肪生成程度。

尽管两种方法都显示出相似的细胞群分布和活力，但与荧光激活细胞分选相比，磁激活细胞分选分离可产生更多的细胞用于培养。在这个代表性实验中，从雄性大鼠的胸主动脉、肠系膜小阻力血管和性腺脂肪组织中分离的磁性激活细胞分选的基质血管部分和脂肪细胞祖细胞的体外增殖，在铺板后 8、24、48 和 96 小时，使用定量 DNA 测定。除了来自胸主动脉的脂肪细胞祖细胞外，在任何时间点均未观察到基质血管分数扩增速率的位点差异，与来自同一部位的基质血管细胞相比，它在 96 小时时表现出增殖较少。

用骨形态发生蛋白 4 刺激融合的脂肪细胞祖细胞 48 小时诱导脂肪细胞分化，通过荧光脂质摄取测定和油红 O 染色评估，液滴中脂质积累增加证明。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 8 小时内完成。在尝试此程序时，请务必记住在隔离步骤中保持 4 摄氏度的温度。

看完这个视频后，您应该对如何分离和分化脂肪细胞祖细胞有了很好的了解。